Как определить количество клеток суспензии: решение

Дано: в 10 больших квадратах камеры Горяева насчитали $a = 128$ клеток, глубина камеры $h = 0{,}1$ мм, перед заполнением камеры суспензию развели в $k = 10$ раз; параллельно из разведения $10^{-4}$ высеяли $V = 0{,}1$ мл и получили $C = 240$ колоний. Найти: количество клеток в 1 мл исходной суспензии и количество КОЕ в 1 мл.

Количество клеток в суспензии считают двумя разными способами, и оба нужны: камера Горяева даёт общее число клеток, а посев на плотную среду - только те, что способны дать колонию. Ответ: 3,2·10⁷ клеток/мл по камере и 2,4·10⁷ КОЕ/мл по высеву, то есть жизнеспособны 75 % клеток. Калькулятор сверху пересчитывает обе величины под твои квадраты, разведения и число колоний, а ниже разобран каждый шаг.

Решение по шагам

Шаг 1. Найти объём одного большого квадрата сетки. Большой квадрат камеры Горяева имеет площадь $1/25$ мм², то есть $0{,}04$ мм², а высота столбика жидкости над сеткой задана глубиной камеры:

$$V_{\text{кв}} = S \cdot h = 0{,}04 \cdot 0{,}1 = 0{,}004\ \text{мм}^3 = 0{,}004\ \text{мкл}$$

Кубический миллиметр и микролитр - это одно и то же, поэтому перевода единиц здесь не требуется, достаточно просто переписать результат.

Шаг 2. Посчитать среднее число клеток на квадрат. Считают не один квадрат, а несколько: клетки ложатся на сетку случайно, и по одному квадрату ошибка будет огромной.

$$\bar{a} = \frac{a}{n} = \frac{128}{10} = 12{,}8\ \text{клетки на квадрат}$$

Шаг 3. Пересчитать на 1 мл. В одном миллилитре 1000 мкл, значит объём квадрата укладывается в миллилитр $1000 / 0{,}004 = 2{,}5 \cdot 10^5$ раз. Остаётся вернуть разведение, умножив на $k$:

$$X = \frac{a}{n} \cdot \frac{1000}{V_{\text{кв}}} \cdot k = 12{,}8 \cdot 2{,}5 \cdot 10^{5} \cdot 10 = 3{,}2 \cdot 10^{7}\ \text{клеток/мл}$$

Шаг 4. Посчитать КОЕ по высеву. Каждая колония на чашке выросла из одной жизнеспособной клетки, поэтому число колоний делят на объём высева и на кратность разведения:

$$N = \frac{C}{V \cdot d} = \frac{240}{0{,}1 \cdot 10^{-4}} = \frac{240}{10^{-5}} = 2{,}4 \cdot 10^{7}\ \text{КОЕ/мл}$$

Шаг 5. Сверить два числа. Отношение показывает долю клеток, сохранивших способность размножаться:

$$\frac{N}{X} = \frac{2{,}4 \cdot 10^{7}}{3{,}2 \cdot 10^{7}} = 0{,}75 = 75\ \%$$

Ответ: 3,2·10⁷ клеток/мл общего количества, 2,4·10⁷ КОЕ/мл жизнеспособных, доля живых клеток 75 %.

Формула пересчёта на 1 мл и откуда в ней берутся множители

Вся формула камерного счёта - это одно рассуждение: мы посчитали клетки в крошечном известном объёме и растянули результат до миллилитра. Никакой биологии в множителе нет, только геометрия сетки и глубина камеры.

Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, каждый из которых разделён ещё на 16 малых. Отсюда два рабочих множителя, и путать их нельзя:

Буква $a$ - суммарное число клеток во всех просчитанных квадратах, $n$ - число этих квадратов, $k$ - во сколько раз разбавили суспензию перед заливкой камеры. Разведение стоит в числителе именно потому, что считали мы уже разбавленную жидкость: чтобы вернуться к исходной концентрации, счёт надо умножить обратно.

Счёт ведут не по всем 225 квадратам подряд, а по диагонали, обычно по 5, 10 или 25 квадратам. Клетки, лежащие на границе квадрата, засчитывают по правилу двух сторон: попадают в счёт только те, что касаются левой и верхней линий, остальные отходят соседнему квадрату. Без этого правила пограничные клетки посчитались бы дважды и результат вырос бы процентов на десять.

Метод разведений и посев: почему КОЕ всегда меньше

Второй способ вообще не требует микроскопа. Суспензию разводят стерильным физраствором десятикратными шагами, из подходящего разведения высевают известный объём на агар и через сутки считают выросшие колонии. Колония считается потомством одной клетки, отсюда и единица: колониеобразующая единица, КОЕ.

Ключевое ограничение - на чашке должно вырасти от 30 до 300 колоний. Меньше 30 - слишком велика случайная погрешность, каждая лишняя колония сдвигает ответ на проценты. Больше 300 - колонии сливаются, конкурируют за питательные вещества, часть мелких просто не вырастает. График в калькуляторе сверху показывает эту полосу: при нашей концентрации в неё попадает ровно одна чашка, из разведения $10^{-4}$, поэтому её и считали.

Разница между 3,2·10⁷ и 2,4·10⁷ не ошибка расчёта. В камере видны все клетки: живые, мёртвые и те, что повреждены и уже не поделятся. На агаре вырастают только жизнеспособные, да ещё и не каждая: слипшиеся в пару или цепочку клетки дают одну колонию, а значит часть живых клеток просто не видна. Поэтому КОЕ практически всегда ниже камерного счёта, и соотношение этих чисел - рабочая характеристика культуры. Перед посевом полезно заранее посчитать, сколько среды понадобится на партию чашек: это отдельная задача, разобранная в материале как определить объём питательной среды.

Как меняется расчёт при других данных

Считали малые квадраты. Множитель становится 4·10⁶ вместо 2,5·10⁵. Для плотных суспензий это удобнее: в большом квадрате может оказаться под сотню клеток, и глаз собьётся.

Разведение не 1:10. Множитель $k$ просто меняется. Важно, что разведение для камеры и разведение для посева - разные вещи: первое делают, чтобы клетки не наслаивались в поле зрения, второе - чтобы на чашке получилось счётное число колоний.

Высевали не 0,1 мл, а 1 мл. При глубинном посеве, когда суспензию вносят в расплавленный агар, делить нужно на 1,0, а не на 0,1, иначе результат окажется завышенным ровно на порядок.

Нужна доля живых напрямую. Клетки подкрашивают метиленовым синим: мёртвые пропускают краситель и синеют, живые остаются бесцветными. Тогда долю жизнеспособных считают прямо в камере, а высев служит проверкой.

Известна скорость роста. Если суспензия растёт, концентрация меняется, пока вы её считаете. Пересчитать численность на любой момент времени помогает разбор как определить число делений клетки, а выбор среды для конкретного микроорганизма описан в статье про элективные среды для бактерий.

Частые ошибки

• Забыли умножить на разведение. Самая частая потеря целого порядка: считали разбавленную в 10 раз суспензию, а ответ записали как исходную концентрацию.
• Перепутали множители квадратов. 2,5·10⁵ для большого квадрата и 4·10⁶ для малого отличаются в 16 раз, ровно во столько же раз ошибётся ответ.
• Посчитали один квадрат вместо десяти. Распределение клеток по сетке случайное, по одному квадрату разброс достигает десятков процентов.
• Считали чашку с 5 или с 600 колониями. Вне полосы 30-300 результат недостоверен, нужно брать соседнее разведение, а не пересчитывать эту чашку аккуратнее.
• Делили на объём разведения, а не на объём высева. В знаменателе стоит именно то количество миллилитров, которое попало на чашку, а не объём пробирки с разведением.
• Ждут совпадения камеры и посева. Эти методы меряют разное, и равенство чисел было бы как раз подозрительным.

FAQ

Зачем нужна камера, если есть посев? Камера даёт ответ за пять минут и показывает общее число клеток, включая мёртвые. Посев занимает сутки, зато считает только живые. В протоколах их часто приводят вместе, потому что вместе они описывают состояние культуры полнее, чем по отдельности.

Можно ли считать бактерии в камере Горяева? Технически да, но неудобно: бактериальные клетки на пределе разрешения светового микроскопа, их трудно отличить от частиц среды. Камеру применяют для дрожжей, спор, клеток крови и культур клеток, а бактерии обычно считают посевом или по оптической плотности.

Сколько параллельных чашек нужно? Стандартно высевают не меньше двух-трёх из каждого разведения и берут среднее. Разброс параллельных высевов свыше 20-30 % говорит о плохом перемешивании суспензии или о неточном дозировании пипеткой.

Что делать, если клетки слиплись? Суспензию перед счётом тщательно перемешивают, иногда обрабатывают ультразвуком. Слипшиеся клетки одинаково портят оба метода: в камере их легко посчитать как одну, а на чашке агрегат из пяти клеток даст одну колонию.

Коротко

1. Объём большого квадрата камеры Горяева при глубине 0,1 мм равен 0,004 мкл, малого - 0,00025 мкл.
2. Количество клеток в 1 мл: $X = (a/n) \cdot (1000/V_{\text{кв}}) \cdot k$; в примере $12{,}8 \cdot 2{,}5 \cdot 10^5 \cdot 10 = 3{,}2 \cdot 10^7$ клеток/мл.
3. Количество КОЕ в 1 мл: $N = C/(V \cdot d)$; в примере $240 / (0{,}1 \cdot 10^{-4}) = 2{,}4 \cdot 10^7$ КОЕ/мл.
4. Считать можно только ту чашку, где выросло от 30 до 300 колоний.
5. Отношение $N/X = 0{,}75$ означает, что жизнеспособны 75 % клеток суспензии; камера считает все клетки, посев - только живые.