Ультрацентрифугирование белков: скорость, S и градиенты

Ультрацентрифуга не «взвешивает» белок напрямую: она заставляет частицы двигаться в очень сильном поле и наблюдает, как быстро и где они распределяются. Из этого движения получают размер, форму, степень агрегации и иногда молекулярную массу. Именно исследования дисперсных систем принесли Теодору Сведбергу Нобелевскую премию по химии 1926 года по данным Нобелевского комитета. Важно не смешивать поле ротора с результатом измерения: первое задаётся частотой и радиусом, второе зависит также от частицы и раствора.

От вращения к ускорению в тысячах g

Если ротор делает $n$ оборотов в минуту, его угловая скорость равна $\omega=2\pi n/60$. В точке на расстоянии $r$ от оси центростремительное ускорение составляет

$a=\omega^2r.$

Например, при $n=50\,000$ об/мин и $r=0{,}08$ м получаем $\omega\approx5236\ \mathrm{рад/с}$ и $a\approx2{,}19\cdot10^6\ \mathrm{м/с^2}$. Деление на стандартное $g=9{,}80665\ \mathrm{м/с^2}$ даёт примерно $224\,000\ g$. Это объясняет, почему малые белковые частицы, которые почти не оседают под обычной гравитацией, заметно смещаются в ячейке. Но два образца при одном и том же $a$ могут вести себя по-разному: на них влияют плавучесть, вязкое сопротивление и диффузия.

Коэффициент седиментации и единица Сведберга

Скорость движения границы белка $v$ растёт с расстоянием от оси. Поэтому удобна нормированная величина

$s=\frac{v}{\omega^2r}=\frac{m(1-\bar v\rho)}{f},$

где $m$ - масса частицы, $\bar v$ - её парциальный удельный объём, $\rho$ - плотность раствора, а $f$ - коэффициент трения. Единица Сведберга: $1\ \mathrm{S}=10^{-13}\ \mathrm{с}$; это именно время, а не масса. Такое определение приведено и в справочнике IUPAC Green Book.

Большая и более плотная частица обычно имеет большее $s$, но вытянутая форма увеличивает трение, а растворитель с близкой плотностью уменьшает эффективную массу. Поэтому нельзя превращать S в дальтоны одной постоянной. Эта гидродинамическая логика полезна и при обсуждении фолдинга белка и шаперонов: изменение компактности может сдвинуть седиментацию без изменения аминокислотной последовательности.

Рассчитать для своей задачи

Почему 30S плюс 50S даёт 70S

У бактериальной рибосомы малая субъединица обозначается 30S, большая - 50S, а собранная частица - 70S. Это не ошибка арифметики: S неаддитивна. При сборке меняются общая форма, гидратация и коэффициент трения $f$; именно они входят в знаменатель формулы. У двух субъединиц нельзя сложить их отдельные скорости оседания и получить скорость комплекса. Детальный состав этих частиц разобран в статье о структуре прокариотической рибосомы 70S.

Полезная проверка на экзамене: массы субъединиц складываются в массу комплекса, если ничего не потеряно, а коэффициенты седиментации - нет. По той же причине два белка одинаковой молекулярной массы могут иметь разные S, если один глобулярный, а другой вытянутый.

Уравнение Сведберга: как появляется молекулярная масса

Одного коэффициента $s$ для массы недостаточно: в нём спрятано трение. Если дополнительно измерить коэффициент диффузии $D$, трение исключается:

$M=\frac{sRT}{D(1-\bar v\rho)},$

где $M$ - молярная масса, $R$ - газовая постоянная, $T$ - абсолютная температура. Это уравнение Сведберга применяют к разбавленному раствору одной не взаимодействующей компоненты. Если белок обратимо образует димер, осадочная граница и диффузия отражают смесь состояний; подстановка одного «среднего» числа без модели даст вводящую в заблуждение массу. Обзор аналитической ультрацентрифуги подробно выводит обе связи и их ограничения в Methods in Enzymology.

Скоростная и равновесная седиментация

В опыте скоростной седиментации ротор быстро запускают и следят, как границы зон перемещаются во времени. Метод чувствителен к распределению размеров, форме и агрегации: у мономера и агрегата могут появиться разные движущиеся границы. Диффузия одновременно размывает каждую границу, поэтому данные описывают уравнением Ламма, а не только положением одной полосы.

В равновесной седиментации выбирают меньшую скорость и ждут, пока поток частиц наружу уравновесится диффузией внутрь. Граница не «пробегает» ячейку; формируется стационарный радиальный градиент концентрации. Для идеальной частицы его форма экспоненциально зависит от $M\omega^2(r^2-r_0^2)/(2RT)$. Такой режим особенно полезен для оценки молярной массы и равновесий мономер - олигомер, но требует времени и контроля температуры.

Оптическая система прибора измеряет не отдельную молекулу, а профиль концентрации по радиусу. Поэтому «одна полоса» ещё не доказывает однородность: близкие по седиментации компоненты могут перекрываться, а широкий профиль появляется и из-за диффузии. Надёжный вывод строят по серии концентраций и скоростей, сверяя модель с формой всего профиля. Такой подход отделяет реальное образование димера от артефакта перегрузки ячейки.

Рассчитать для своей задачи

Дифференциальное центрифугирование органоидов

Препаративное центрифугирование отвечает на другой вопрос: какую фракцию собрать, а не какой параметр точно измерить. После мягкого разрушения клеток сначала осаждают крупные ядра, затем при большей скорости - митохондрии и другие крупные органоиды; ещё более быстрые режимы обогащают мелкие везикулы и рибосомы. Это последовательное снятие осадков называют дифференциальным центрифугированием. Оно даёт фракции, а не абсолютно чистые органоиды: частицы разной формы и плотности перекрываются. Классическое описание этой последовательности есть в учебнике NCBI Molecular Biology of the Cell.

После такого разделения имеет смысл проверить белковые комплексы и другими методами: например, электрофорез ДНК показывает разделение заряженных фрагментов в геле, но не заменяет седиментационное измерение белка в растворе.

Градиенты сахарозы и CsCl

Градиент сахарозы стабилизирует слой жидкости: сверху раствор легче, снизу плотнее. При зональном разделении образец кладут сверху; частицы проходят разный путь с разными скоростями и образуют зоны. Здесь решают размер, форма и плотность, то есть значение $s$, а опыт останавливают до того, как зоны достигнут дна.

В изопикническом градиенте каждая частица идёт до слоя, где плотность среды равна её плавучей плотности. Дальше эффективная центробежная сила исчезает, и полоса остаётся на своей позиции; длительность после достижения равновесия уже не меняет координату. Цезий-хлорид образует устойчивый плотностный градиент при центрифугировании. Именно такой принцип использовали Мезельсон и Сталь в опытах с тяжёлой и лёгкой ДНК; ранняя работа об равновесии макромолекул в градиентах опубликована ими с Виноградом в PNAS. Не следует переносить этот результат на сахарозный градиент: в нём обычно читают скорость зон, а не только плотность равновесной полосы.

Что показывает метод для белка

Аналитическая ультрацентрифуга работает с белком в растворе, без фиксации на матрице. Это ценно, когда нужно увидеть равновесие мономер - димер, слабую агрегацию или изменение конформации. Однако результат относится к заданным буферу, температуре и концентрации: смена соли может изменить ассоциацию, а вязкость - форму границы. Для внутриклеточного контекста важно также не путать лабораторное фракционирование с клеточной логистикой: распределение белков по адресам описывает сортировка белков в аппарате Гольджи, а центрифуга только разделяет уже полученный материал.

Перед постановкой опыта полезно сформулировать, что именно будет критерием ответа. Если нужен чистый материал для следующего анализа, выбирают режим фракционирования и затем проверяют фракции маркерами. Если нужно установить, образует ли белок комплекс, важнее серия аналитических измерений при нескольких концентрациях. Появление более быстро оседающей компоненты совместимо с димером или агрегатом, но само по себе не доказывает ни один из вариантов. Нужны согласованная модель, контроль буфера и независимая проверка состава. Так ультрацентрифуга остаётся не «машиной для осадка», а методом, который связывает наблюдаемую границу с физическими свойствами частиц в растворе.

Частые ошибки

• Считать S молекулярной массой. S зависит от массы, формы, гидратации, трения и плотности среды.
• Складывать S субъединиц. Обозначение 30S + 50S = 70S описывает изменение гидродинамики комплекса, а не обычную сумму.
• Путать g и S. $g$ характеризует поле ротора, S - ответ конкретной частицы в этом поле.
• Называть любой градиент изопикническим. В сахарозе часто разделяют движущиеся зоны, а в CsCl частицы могут остановиться на своей плавучей плотности.

FAQ

Можно ли по одному S назвать массу белка? Нет. Нужны дополнительные данные о диффузии или форме, либо независимое измерение; для разбавленной не взаимодействующей системы используют уравнение Сведберга.

Почему при большей скорости белок не всегда оседает «лучше»? Рост $\omega$ ускоряет седиментацию, но усиливает нагрев, конвекцию и требования к устойчивости образца; режим выбирают под вопрос опыта.

Чем аналитическая ультрацентрифуга отличается от препаративной? В аналитической измеряют оптический сигнал и извлекают параметры частиц; в препаративной главным результатом служит собранная фракция.

Коротко

Ультрацентрифугирование белков связывает механику ротора с гидродинамикой частицы. Ускорение рассчитывают как $a=\omega^2r$, коэффициент S показывает скорость оседания с учётом массы, формы и трения, а уравнение Сведберга использует вместе S и диффузию для оценки массы. Скоростная седиментация читает движение границ, равновесная - стационарный градиент, а сахароза и CsCl отвечают разным стратегиям разделения.