Сортировка белков в Гольджи: как клетка их адресует

Через аппарат Гольджи проходит почти всё, что клетка синтезирует на шероховатом ЭПР: ферменты лизосом, гормоны, коллаген, рецепторы плазматической мембраны и слизь. Все эти белки входят в стопку цистерн одним общим потоком, а выходят по разным адресам, причём почти без ошибок. Сортировка белков в Гольджи и есть тот механизм, который превращает единый поток в набор адресованных посылок: сначала белок получает химическую метку, затем в транс-сети её читает рецептор и упаковывает груз в нужный тип везикулы. Ниже разобрано, чем различаются отделы стопки, какие сигналы служат адресами и как посчитать, сколько потока уйдёт по каждому маршруту.

Аппарат Гольджи как сортировочная станция

Стопка Гольджи полярна: у неё есть вход и выход. Со стороны ЭПР лежит цис-сторона, куда приходят транспортные везикулы, покрытые белком COPII; на противоположном конце находится транс-сторона, переходящая в разветвлённую транс-сеть Гольджи. Между ними - медиальные цистерны. Полярность поддерживается двумя встречными потоками: груз движется вперёд вместе с созревающими цистернами, а ферменты и ЭПР-резиденты едут назад в COPI-везикулах. Именно поэтому стопка не перемешивается: каждая цистерна удерживает свой набор ферментов, хотя её содержимое постоянно обновляется.

Вдоль стопки натянут градиент кислотности: в цис-цистернах pH около 6,7, в транс-сети - примерно 6,0. Этот градиент не декорация, а рабочий инструмент сортировки: связывание рецепторов с грузом зависит от pH, и белок, схваченный в транс-сети, отпускается уже в закисленной эндосоме. Второй общий инструмент - концентрация ионов кальция, которая в транс-сети нужна для агрегации секреторных белков.

Цис, медиальная и транс: три отдела с разными ферментами

Отделы стопки различаются не формой, а ферментным набором, и порядок этих наборов задаёт последовательность модификаций.

• Цис-цистерна. Здесь маннозидаза I отрезает лишние остатки маннозы от олигосахарида, пришедшего из ЭПР, а GlcNAc-фосфотрансфераза навешивает фосфат на маннозу будущих лизосомных ферментов.
• Медиальная цистерна. Работают маннозидаза II и GlcNAc-трансфераза I, добавляется фукоза. Гликан теряет однообразную маннозную структуру и становится ветвистым.
• Транс-цистерна и транс-сеть. Галактозилтрансфераза и сиалилтрансфераза достраивают концевые остатки; отрицательно заряженная сиаловая кислота становится последним звеном цепочки. Здесь же снимается защитный остаток GlcNAc, и метка манноза-6-фосфат наконец открывается для рецептора.

Порядок жёсткий: фермент следующего отдела не может работать раньше, чем отработал предыдущий. Отсюда практическое следствие для лабораторной работы: по составу сахаров на белке можно сказать, до какой цистерны он успел дойти.

Гликозилирование как метка маршрута

Гликозилирование начинается ещё в ЭПР, но именно в Гольджи оно превращается из общей модификации в индивидуальную. Одна и та же исходная цепочка после прохождения стопки даёт разные структуры - и различия эти небезразличны для маршрута.

Рассчитать для своей задачи

Для лизосомных гидролаз химическая метка на сахаре и есть адрес. Для остальных белков гликан работает мягче: он повышает растворимость, защищает от протеаз, участвует в узнавании клетками друг друга. Подробнее о том, как ковалентные довески вообще меняют судьбу белка, разобрано в статье про посттрансляционную модификацию; там же видно, что гликозилирование - самая объёмная из модификаций по массе. А сама химия связи между сахаром и белком описана в разборе гликозидной связи.

Сигналы сортировки: манноза-6-фосфат и KDEL

Клетка использует два принципиально разных типа адресов: положительный сигнал «отправить туда» и отрицательный сигнал «вернуть обратно».

Рассчитать для своей задачи

Манноза-6-фосфат (М6Ф) - адрес лизосомы. Фермент, предназначенный для лизосомы, узнаётся фосфотрансферазой не по короткому мотиву, а по трёхмерному участку поверхности: несколько удалённых по цепи остатков сходятся вместе только у правильно свёрнутого белка. Поэтому сборка гидролаз и качество их фолдинга напрямую влияют на адресацию. В транс-сети метку М6Ф читает рецептор MPR, а в закисленной поздней эндосоме отпускает груз и возвращается назад.

KDEL - сигнал возврата. Растворимые белки ЭПР (шапероны BiP, кальретикулин, протеиндисульфидизомераза) заканчиваются последовательностью Lys-Asp-Glu-Leu. Хитрость в том, что удержание работает не в самом ЭПР, а уже в Гольджи: KDEL-рецептор связывает сигнал при кислом pH цистерн и отпускает при нейтральном pH ЭПР, куда груз доставляется COPI-везикулами. У мембранных белков ЭПР ту же роль играет дилизиновый мотив KKXX на цитозольном конце.

Утечка при этом не нулевая, но безобидна: если за один проход возвращается доля $r$, то вероятность того, что белок ускользнёт наружу после $n$ проходов, равна $(1-r)^n$, а среднее число циклов ЭПР - Гольджи - ЭПР составляет

$\bar{n} = \frac{1}{1-r}.$

При $r = 0{,}95$ белок в среднем выдерживает 20 циклов возврата, и лишь малая часть пула теряется со временем.

Транс-сеть Гольджи: узел ветвления

Транс-сеть - не просто последняя цистерна, а отдельная тубулярная станция, где поток расходится. Здесь на мембрану садятся адаптерные комплексы: AP-1 и GGA собирают клатриновую оболочку вокруг участков с рецепторами MPR, отправляя груз в эндосомы; другие участки отпочковываются без клатрина.

Рассчитать для своей задачи

Дальше везикулы не плывут наугад: их тащат моторы по микротрубочкам, а конкретный адрес подтверждается парой белков SNARE при стыковке. Механика этой доставки разобрана в статьях про моторные белки динеин и кинезин и про эндоцитоз и экзоцитоз - там же описано, как мембрана везикулы сливается с мишенью и возвращается обратно.

Три маршрута и путь по умолчанию

Из транс-сети ведут три дороги, и различаются они наличием сигнала.

1. Конститутивная секреция - путь по умолчанию. Никакого сигнала не требуется: белок, у которого нет ни М6Ф, ни склонности к агрегации, попадает в везикулу автоматически и уходит к плазматической мембране непрерывным потоком. Так секретируются альбумин, коллаген, компоненты внеклеточного матрикса.
2. Регулируемая секреция - есть у эндокринных, экзокринных и нервных клеток. Проинсулин, зимогены поджелудочной железы и гормоны агрегируют в транс-сети при pH около 6,0 и высоком кальции, отделяются от растворимого груза и запасаются в плотных гранулах до сигнала кальция.
3. Лизосомный путь - по метке М6Ф через рецептор MPR и эндосому.

Отдельно стоит помнить и о четвёртой дороге, которую легко забыть на экзамене: ретроградный возврат в ЭПР по сигналу KDEL. Он не выводит белок из системы, а закольцовывает поток.

Как посчитать баланс потоков

Модель в калькуляторе выше сводит всё сказанное к арифметике долей. Пусть в цис-цистерну входит поток $\Phi_0 = 100$ условных единиц, доля $k$ приходится на ЭПР-резиденты, ускользнувшие вперёд, а на транс-сеть попадает груз $\Phi_0(1-k)$. Тогда в лизосомы уйдёт

$\Phi_{\text{лиз}} = \Phi_0\,(1-k)\,f_{\text{М6Ф}}\,e_{\text{MPR}},$

где $f_{\text{М6Ф}}$ - доля груза с меткой, а $e_{\text{MPR}}$ - эффективность захвата рецептором. При настройках по умолчанию ($k = 8\%$, $f_{\text{М6Ф}} = 15\%$, $e_{\text{MPR}} = 90\%$) получаем $100 \cdot 0{,}92 \cdot 0{,}15 \cdot 0{,}90 = 12{,}4$ единицы в лизосомы, 27,6 единицы в секреторные гранулы, 7,6 единицы обратно в ЭПР и 52,4 единицы в конститутивную секрецию.

Модель хорошо показывает патологию. Опустите захват рецептором MPR до 10 %: в лизосомы попадёт 1,4 % потока, а конститутивная секреция вырастет до 63,4 %. Это и есть картина I-клеточной болезни (муколипидоза II), где дефект фосфотрансферазы лишает гидролазы метки: ферменты в высоких концентрациях обнаруживаются в крови, а в клетках накапливаются включения непереваренного материала.

Частые ошибки

• Считать конститутивную секрецию сигнальным путём. Наоборот: она работает по умолчанию, сигнал нужен как раз тем белкам, которые из этого потока изымают.
• Путать удержание в ЭПР с возвратом из Гольджи. Сигнал KDEL не мешает белку покинуть ЭПР, он обеспечивает возврат уже уехавшего.
• Говорить, что метка М6Ф ставится в транс-сети. Фосфат навешивается в цис-отделе, а в транс-сети лишь снимается прикрывающий остаток GlcNAc и метку читает рецептор.
• Считать рецептор MPR расходуемым. Он циркулирует между транс-сетью и эндосомой десятки раз; груз отпускается из-за падения pH, а не из-за разрушения рецептора.
• Смешивать аппарат Гольджи с однофамильцами. Сухожильный орган Гольджи и клетки Гольджи мозжечка названы в честь того же гистолога, но к сортировке белков отношения не имеют.

FAQ

Что произойдёт, если аппарат Гольджи выключить? При обработке клеток брефельдином A стопка распадается, а её ферменты сливаются с ЭПР. Секреция останавливается, лизосомные гидролазы не получают метку, гликаны остаются в незрелой маннозной форме. Клетка какое-то время живёт, но обновлять мембрану и секретировать перестаёт.

Как экспериментально узнать, где остановился белок? По устойчивости гликана к эндогликозидазе H: пока белок не прошёл медиальную цистерну, его гликан расщепляется этим ферментом, а после обработки GlcNAc-трансферазой I становится устойчивым. Дополнительно применяют температурный блок 20 °C, при котором груз накапливается в транс-сети.

Все ли лизосомные белки адресуются через манноза-6-фосфат? Нет. Мембранные белки лизосом несут сигналы в цитозольном хвосте, которые узнают адаптеры AP-3 и AP-1, а некоторые гидролазы попадают в лизосому альтернативными путями. Именно поэтому при I-клеточной болезни страдают не все клетки одинаково: в гепатоцитах работает запасной механизм.

Коротко

Сортировка белков в Гольджи устроена как последовательное чтение адреса: цис-, медиальная и транс-цистерны по очереди достраивают гликан и ставят метки, а транс-сеть Гольджи разводит поток по трём маршрутам - конститутивной секреции как пути по умолчанию, регулируемой секреции через агрегацию в гранулы и лизосомному пути по метке манноза-6-фосфат. Четвёртая дорога, возврат в ЭПР по сигналу KDEL, замыкает систему и удерживает резидентные шапероны на месте. Все сигналы работают через pH-зависимое связывание с рецепторами, поэтому поломка одного фермента, как при I-клеточной болезни, перенаправляет целый поток белков не по адресу.