Посттрансляционная модификация белка: типы и функции

Посттрансляционная модификация - это ковалентное химическое изменение белка уже после того, как рибосома собрала полипептидную цепь: к отдельным аминокислотным остаткам присоединяются фосфатные, ацетильные и метильные группы, разветвлённые углеводные цепи, липидные хвосты или даже целые небольшие белки вроде убиквитина. Геном человека кодирует около 20 тысяч белков, а реальное разнообразие протеома на порядки больше - и обеспечивает эту разницу именно набор модификаций: один и тот же белок в разных состояниях работает то как активный фермент, то как молчащий каркас, то как мишень для уничтожения. Разберём основные типы модификаций, их мишени на цепи и то, как модификацию обнаруживают экспериментально по сдвигу массы. Чтобы сразу увидеть, на сколько дальтон тяжелеет белок от каждой метки, посчитайте сдвиг в калькуляторе ниже, а дальше разберём каждый тип отдельно.

Что такое посттрансляционная модификация

Формально посттрансляционная модификация (ПТМ) - любое изменение белка после завершения биосинтеза белка на рибосоме. Сюда попадают три разные по смыслу вещи: присоединение химической группы, присоединение целого белка-метки и необратимое разрезание цепи протеазой. Последнее часто забывают, хотя это классика: проинсулин превращается в зрелый инсулин именно вырезанием C-пептида, а пищеварительные ферменты хранятся в виде неактивных зимогенов и активируются протеолизом уже в просвете кишечника.

Ключевое деление - на обратимые и необратимые модификации. Обратимая метка имеет свою пару ферментов: один навешивает, другой снимает (киназа и фосфатаза, ацетилтрансфераза и деацетилаза). Такая пара превращает белок в переключатель, который клетка может гонять туда-обратно за секунды. Необратимая - гидроксилирование пролина в коллагене, разрезание цепи, гликирование - меняет белок насовсем, и единственный способ отменить её результат для клетки состоит в том, чтобы синтезировать белок заново.

Рассчитать для своей задачи

В базах данных описано свыше четырёхсот химически различимых типов модификаций, но подавляющая часть биологии держится на полутора десятках самых частых. Именно они и разбираются в курсах молекулярной биологии.

Какие аминокислоты становятся мишенями

Модификация не может сесть куда угодно: нужна боковая цепь с подходящей химией - гидроксильной, аминной или тиольной группой. Отсюда жёсткое соответствие метки и остатка:

• Серин, треонин, тирозин - гидроксильная группа принимает фосфат.
• Лизин - свободная аминогруппа принимает ацетил, метил, убиквитин, SUMO; лизин универсален и потому служит точкой конкуренции разных сигналов.
• Аргинин - метилирование (моно- и диметилирование, симметричное или асимметричное).
• Аспарагин в секвоне Asn-X-Ser/Thr, где X - любой остаток кроме пролина, принимает N-связанный гликан.
• Цистеин - тиольная группа принимает пальмитат, участвует в дисульфидных связях и в окислительных модификациях.
• Пролин - гидроксилирование, критичное для тройной спирали коллагена.
• N-концевой глицин - миристоилирование, заякоривающее белок в мембране.

Одна и та же боковая цепь может нести только одну метку одновременно, поэтому модификации на соседних остатках работают как логическая схема: фосфорилирование рядом с лизином способно блокировать его ацетилирование, и наоборот.

Фосфорилирование: обратимый выключатель клетки

Фосфорилирование - самая изученная посттрансляционная модификация. В геноме человека около 518 протеинкиназ и порядка 200 фосфатаз, а хотя бы один фосфосайт находят у большинства клеточных белков. Перенос идёт с γ-фосфата АТФ на гидроксильную группу остатка; фосфатная группа несёт два отрицательных заряда и объёмна, поэтому она перестраивает локальную конформацию и создаёт площадку для узнавания доменами SH2 и 14-3-3.

Рассчитать для своей задачи

Поскольку киназа и фосфатаза работают на один и тот же сайт одновременно, доля фосфорилированной формы задаётся не одной реакцией, а их соотношением в стационарном состоянии:

$$\theta = \frac{k_{\text{к}}[K]}{k_{\text{к}}[K] + k_{\text{ф}}[P]},$$

где $[K]$ и $[P]$ - активные концентрации киназы и фосфатазы, а $k_{\text{к}}$ и $k_{\text{ф}}$ - их каталитические константы. При равной активности обеих сторон $\theta = 0{,}5$, то есть модифицирована половина молекул. Отсюда важное следствие: сигнал усиливается не только включением киназы, но и подавлением фосфатазы, и клетка постоянно пользуется обоими рычагами.

Ацетилирование и метилирование: настройка хроматина

Ацетилирование лизина снимает его положительный заряд. Для гистонов это принципиально: нейтрализованный лизин слабее держит отрицательно заряженную ДНК, нуклеосома разрыхляется, транскрипция облегчается. Ставят метку ацетилтрансферазы (HAT), снимают деацетилазы (HDAC) - снова обратимая пара.

Метилирование лизина и аргинина заряд не снимает и потому действует иначе: оно создаёт метку, которую читают специальные домены (хромодомен, домен Тюдора). Смысл метки зависит от позиции: триметилирование H3K4 связано с активной транскрипцией, а триметилирование H3K9 - с гетерохроматином и молчанием гена. Один остаток при этом может нести одну, две или три метильные группы, что даёт ещё один уровень кодирования. Совокупность таких меток и называют гистоновым кодом.

Гликозилирование: самая объёмная модификация

Гликозилирование - присоединение углеводных цепей, и по вкладу в массу оно вне конкуренции: у муцинов и многих мембранных рецепторов углеводная часть даёт больше половины молекулярной массы. Различают два основных типа. N-связанное гликозилирование начинается ещё в эндоплазматическом ретикулуме: готовый олигосахаридный блок переносится с липида-переносчика долихолфосфата на аспарагин секвона, а затем подрезается и достраивается в аппарате Гольджи. O-связанное гликозилирование идёт в Гольджи и наращивается остаток за остатком на серине или треонине.

У N-гликана есть и контролирующая роль: система кальнексина и кальретикулина узнаёт незрелый гликан и удерживает белок в цикле фолдинга с шаперонами, пока тот не свернётся правильно. Неправильно свёрнутый белок в итоге отправляется на деградацию - так гликан работает меткой качества сборки.

Убиквитин и другие белки-метки

Отдельный класс модификаций - присоединение к лизину целого белка. Убиквитин массой около 8,5 кДа навешивается каскадом ферментов E1, E2 и E3, и смысл метки задаёт тип цепи: цепь через лизин-48 направляет субстрат в протеасому, а цепь через лизин-63 работает сигналом в репарации ДНК и во врождённом иммунитете. Подробно этот путь разобран в статье про убиквитин-протеасомную систему.

По той же схеме работают родственные метки: SUMO меняет локализацию и белок-белковые взаимодействия, а NEDD8 активирует куллиновые E3-лигазы. Все они снимаются специализированными протеазами, то есть тоже обратимы.

Как модификацию находят: массовый сдвиг в масс-спектре

Основной инструмент - масс-спектрометрия. Белок режут трипсином на пептиды, измеряют их массы и сравнивают с теоретическими: модифицированный пептид тяжелее ровно на массу присоединённой группы. Характерные моноизотопные сдвиги:

• фосфорилирование $+79{,}966$ Да,
• ацетилирование $+42{,}011$ Да,
• монометилирование $+14{,}016$ Да,
• гидроксилирование $+15{,}995$ Да,
• убиквитинирование $+114{,}043$ Да (остаток Gly-Gly после трипсинолиза),
• миристоилирование $+210{,}198$ Да.

Рассчитать для своей задачи

Общая масса модифицированного белка складывается из массы цепи и суммы всех меток:

$$M_{\text{мод}} = M_0 + \sum_i n_i \,\Delta m_i,$$

где $n_i$ - число сайтов модификации типа $i$. Прибор измеряет не массу, а отношение массы к заряду, поэтому в спектре сдвиг оказывается меньше в $z$ раз:

$$\Delta\!\left(\frac{m}{z}\right) = \frac{\Delta m}{z}.$$

Для фосфопептида с зарядом $2+$ расстояние между пиками составит не 80, а около $39{,}98$ единиц - типичное место ошибки в студенческих расчётах. Поскольку фосфопептидов в смеси мало, их предварительно обогащают на диоксиде титана или на металл-аффинных смолах, а сам сайт определяют уже по фрагментному спектру.

Частые ошибки

• Считают, что посттрансляционная модификация - это только химическая группа. Протеолитическое созревание (проинсулин, зимогены) и присоединение целых белков-меток тоже относятся к ПТМ.
• Округляют массу фосфата до 80 Да. На приборе высокого разрешения различие между $79{,}966$ и, например, сульфированием $79{,}957$ Да принципиально: округление стирает разницу.
• Путают массу с позицией сайта. Обзорный спектр показывает только, что пептид тяжелее; какой именно остаток модифицирован, устанавливают по фрагментации.
• Ждут одного пика от гликопротеина. Гликозилирование даёт набор гликоформ, поэтому в спектре появляется целая серия сигналов, а полоса в геле размывается.
• Приписывают обратимость всем модификациям. У гидроксилирования пролина и у протеолиза фермента-«стирателя» нет.

FAQ

Чем посттрансляционная модификация отличается от мутации? Мутация меняет последовательность ДНК и, соответственно, аминокислотную последовательность всех копий белка. Модификация последовательность не трогает: она обратимо навешивается на готовую цепь и затрагивает лишь часть молекул в конкретный момент.

Сколько типов модификаций известно? В специализированных базах описано более четырёхсот вариантов, но на практике в учебных задачах фигурируют фосфорилирование, ацетилирование, метилирование, гликозилирование, убиквитинирование, липидные модификации и гидроксилирование.

Видно ли модификацию в обычном электрофорезе? Крупные модификации - да: гликозилированный белок и полиубиквитинированный субстрат заметно замедляют ход в геле. Фосфорилирование добавляет всего около 80 Да и в стандартном SDS-электрофорезе обычно неразличимо, для него применяют фосфоспецифичные антитела или гели с Phos-tag.

Коротко

Посттрансляционная модификация - ковалентное изменение белка после трансляции: присоединение группы, белка-метки или разрезание цепи. Мишень определяется химией боковой цепи: фосфат садится на серин, треонин и тирозин, ацетил и убиквитин - на лизин, гликан - на аспарагин в секвоне. Обратимые модификации работают парами ферментов и делают белок переключателем, доля активной формы задаётся соотношением активностей киназы и фосфатазы. Обнаруживают модификацию по сдвигу массы в масс-спектре, помня, что в шкале $m/z$ сдвиг делится на заряд иона.