Моторные белки динеин и кинезин: транспорт по микротрубочкам

Моторные белки динеин и кинезин - это ATP-зависимые наномашины, которые ходят по микротрубочкам, как локомотивы по рельсам, и перетаскивают везикулы, органеллы, мРНК и хромосомы между удалёнными частями клетки. В отличие от миозинового мотора актин-миозиновой пары, они работают не на актине, а на полярных микротрубочках, и именно полярность рельса задаёт направление транспорта: кинезин почти всегда идёт к плюс-концу, динеин - к минус-концу. Ниже - устройство рельса, конструкция обоих моторов, их ATP-цикл, биологические роли, цифры скорости и силы, регуляция и связь с патологией.

Микротрубочки как полярный рельс: плюс- и минус-концы

Микротрубочка - полый цилиндр диаметром $\sim 25\ \mathrm{nm}$ из 13 протофиламентов, каждый собран из чередующихся αβ-тубулиновых димеров. Сам димер ассиметричен: на одном конце наружу торчит β-тубулин (плюс-конец), на другом - α-тубулин (минус-конец). Плюс-конец растёт и разбирается быстро, динамически нестабилен; минус-конец обычно заякорен в MTOC - центросоме у животных клеток или γ-тубулиновом кольцевом комплексе. Эта структурная асимметрия и есть тот «компас», на который ориентируются моторы: один и тот же мотор всегда идёт в одну и ту же сторону по микротрубочке.

В аксоне нейрона микротрубочки уложены параллельно и однонаправленно - плюс-концами от тела клетки к пресинапсису. В дендритах ориентация смешанная. В митотическом веретене плюс-концы интерполярных микротрубочек смотрят к экватору, кинетохорных - к кинетохору хромосомы.

Кинезин: двухголовый шагающий мотор к плюс-концу

Канонический кинезин-1 (KIF5) - гетеротетрамер из двух тяжёлых цепей и двух лёгких. Каждая тяжёлая цепь содержит на N-конце моторный домен размером $\sim 350$ аминокислот с ATP-связывающим карманом и микротрубочко-связывающим участком, гибкий шейный линкер (neck linker), длинный coiled-coil стебель и C-концевой хвост, к которому через лёгкие цепи привязывается груз - обычно через адаптеры на поверхности везикулы.

Шаги - дискретные, по $8\ \mathrm{nm}$ (расстояние между соседними β-тубулинами в протофиламенте), к плюс-концу. Движение процессивно: одна молекула кинезина-1 успевает сделать $\sim 100$ шагов до отрыва, проходя около микрометра. Развиваемая сила одной молекулы - около $5\ \mathrm{pN}$, типичная скорость без нагрузки - $\sim 0{,}8{-}1\ \mathrm{\mu m/s}$.

ATP-цикл кинезина и модель hand-over-hand

Две головки кинезина шагают поочерёдно - модель «нога за ногой», или hand-over-hand: задняя головка отрывается, перешагивает через переднюю и становится новой передней. Полный цикл одной головки:

1. Связывание ATP. Передняя головка прочно связана с микротрубочкой, в её кармане ATP. Связывание ATP вызывает «застёгивание» шейного линкера вдоль моторного домена вперёд - это даёт смещение свободной задней головки в сторону плюс-конца.
2. Гидролиз и поиск нового сайта. Свободная (теперь передняя) головка ищет следующий тубулиновый димер на $8\ \mathrm{nm}$ дальше и связывается с ним. Передняя головка в это время гидролизует ATP до $\mathrm{ADP}\cdot\mathrm{P_i}$.
3. Выход фосфата и отрыв. Из старой задней головки выходит $\mathrm{P_i}$, аффинность к микротрубочке падает, она отрывается с $\mathrm{ADP}$ в кармане и становится новой «свободной» головкой.
4. Замена ADP на ATP в новой передней. В передней головке $\mathrm{ADP}$ обменивается на $\mathrm{ATP}$ - цикл стартует заново.

Координация между двумя головками строго асимметрична: задняя головка не может оторваться, пока передняя не связалась - это и обеспечивает процессивность. На один шаг тратится одна молекула ATP на одну головку.

Динеин: многосубъединичный мотор к минус-концу

Цитоплазматический динеин-1 устроен гораздо сложнее кинезина. Это гомодимер из двух тяжёлых цепей $\sim 530\ \mathrm{kDa}$, каждая из которых содержит AAA+ кольцо из шести доменов (AAA1–AAA6), микротрубочко-связывающий «стебель» MTBD на длинной coiled-coil ножке, отходящей от AAA4–AAA5, и линкер, проходящий через лицо AAA-кольца. К тяжёлым цепям прицеплены промежуточные, лёгкие промежуточные и лёгкие цепи - всего больше десяти субъединиц, плюс адаптерные комплексы.

Главное отличие от кинезина: ATP гидролизуется не в моторе на интерфейсе с рельсом, а внутри AAA1-сайта, и сигнал передаётся через всё кольцо и стебель до MTBD за $\sim 25\ \mathrm{nm}$ от ATP-сайта. Линкер перебрасывается между двумя положениями и тянет груз. Свободный динеин чаще всего сидит в авто-ингибированной «phi»-конформации; включается он только при сборке комплекса с динактином (большая 23-субъединичная сборка) и грузовым адаптером (BICD2, HOOK3, Spindly и др.). Только тройной комплекс «динеин-динактин-адаптер» процессивен и идёт к минус-концу со скоростью $\sim 1\ \mathrm{\mu m/s}$ при силе одной молекулы около $4\ \mathrm{pN}$. Шаги динеина нерегулярны: чаще $8\ \mathrm{nm}$, но бывают и $16$, и $24\ \mathrm{nm}$ - он умеет «перепрыгивать» через протофиламенты.

Везикулярный транспорт: антероградный и ретроградный

В аксоне нейрона грузом моторов служат синаптические везикулы, митохондрии, эндосомы, плотноядерные везикулы с нейропептидами, фрагменты гладкой ER. Антероградный транспорт - от тела клетки к окончанию - идёт на кинезинах (KIF1A для синаптических везикул, KIF5 для митохондрий через адаптеры Milton и Miro). Ретроградный транспорт - от окончания к телу - идёт на цитоплазматическом динеине: возвращающиеся эндосомы, аутофагосомы, сигнальные эндосомы с активированными рецепторами факторов роста, а также вирусы (HSV-1, бешенство), которые «угоняют» динеин для движения к ядру.

Часто на одну везикулу садятся сразу и кинезин, и динеин: направление движения определяется конкуренцией натяжений и переключается регуляторами. Это удобно для разворота груза в ответ на сигнал.

Митотическое веретено и движение хромосом

В митозе кинезины класса 5 (Eg5/KIF11) сшивают антипараллельные интерполярные микротрубочки и расталкивают полюса веретена. Кинезин-13 (MCAK) на плюс-концах кинетохорных микротрубочек катализирует их деполимеризацию, «подтягивая» хромосому. Динеин у кинетохоры тянет хромосому к полюсу и участвует в проверке метафазной пластинки. Без рабочего Eg5 веретено не расходится - отсюда интерес к ингибиторам Eg5 как противоопухолевой терапии.

Жгутики и реснички: аксонемальный динеин

Отдельная линия - аксонемальные динеины: моторы, неподвижно сидящие на одной микротрубочке аксонемы жгутика и циклически отталкивающие соседнюю пару (схема 9+2). Координация по азимуту даёт изгибную волну, которая распространяется вдоль жгутика и обеспечивает плавание сперматозоида или биение ресничек эпителия трахеи. Геометрия другая - мотор стоит, рельс «прокручивается» относительно него. Мутации DNAH5/DNAH11 дают синдром первичной цилиарной дискинезии - хронические бронхиты, обратное расположение органов (синдром Картагенера), бесплодие.

Скорость и сила: цифры, которые стоит запомнить

В тепловых единицах одна молекула ATP даёт $\sim 20\ k_B T \approx 80\ \mathrm{pN\,nm}$ - этого хватает на шаг $8\ \mathrm{nm}$ против силы $5\ \mathrm{pN}$ с КПД $\sim 50\%$. Это близко к термодинамическому пределу для одиночной молекулы.

Регуляция: Tau, Lis1 и адаптеры

Моторные белки регулируются и сверху, и снизу. На уровне рельса белок Tau и MAP2 сидят на поверхности микротрубочки и конкурируют с моторами за связывание; гиперфосфорилирование Tau и его отщепление - отличительная черта болезни Альцгеймера. Lis1 и его партнёр NudE - главные регуляторы динеина: они удерживают мотор в активной конформации и облегчают взятие тяжёлого груза. Кинезины фосфорилируются по C-концевому хвосту (JNK, GSK3β), что меняет связывание с грузом. Грузовые адаптеры BICD2, HOOK3, Spindly, RILP - отдельный «диспетчер»: они выбирают, какой груз посадить на динеин или кинезин.

Патологии моторного транспорта

• SMA (спинальная мышечная атрофия) - дефицит SMN, косвенно нарушен аксональный транспорт в моторных нейронах.
• HSP - мутации в KIF5A нарушают антероградный транспорт в длинных аксонах кортикоспинального тракта.
• BICD2-патии - мутации в адаптере динеина дают спинальную мышечную атрофию нижних конечностей.
• Цилиарные дискинезии - мутации DNAH5/DNAH11 (аксонемальный динеин).
• Лиссэнцефалия - мутации LIS1 нарушают регуляцию цитоплазматического динеина и миграцию нейронов.

Общий мотив: длинные клетки (мотонейроны, фоторецепторы) первыми страдают при нарушении дальнего внутриклеточного транспорта.

Биофизика одиночных молекул: оптические пинцеты

Шаги $8\ \mathrm{nm}$ и сила $5\ \mathrm{pN}$ - это прямые измерения 1990-х годов оптическими пинцетами. Бусина с навешенным мотором удерживается лазерной ловушкой, мотор тянет бусину, и регистрируется ступенчатое смещение. Эксперименты Свобода-Блока (1993) стали стандартом одномолекулярной биофизики. По наклону force-velocity кривой определяют, как меняется скорость с нагрузкой, и при какой силе мотор останавливается (stall force).

Типовые задачи

• Груз к плюс-концу - кинезин (в аксоне обычно KIF1A или KIF5).
• Груз к минус-концу - цитоплазматический динеин с динактином и адаптером.
• Вирус с захваченным динеином - едет к минус-концу: в нейроне к телу клетки, далее к ядру.
• Мутация Lis1 - нарушается ядерная миграция нейробластов, потому что динеин в комплексе с Lis1 тянет ядро по микротрубочкам.

Частые ошибки

• «Кинезин ходит по актину». Нет, по микротрубочкам. По актину ходят миозины.
• «Динеин ходит к плюс-концу». Цитоплазматический и аксонемальный динеин - оба идут к минус-концу. Известных «плюс-направленных» динеинов у эукариот нет.
• «Кинезинов всего один тип». В геноме человека $\sim 45$ кинезинов из 14 семейств; разные кинезины делают разное (везикулы, митоз, деполимеризация плюс-концов).
• «ATP двигает шейный линкер, и сразу шаг». ATP не сам двигает - он, связавшись, стабилизирует «застёгнутую» вперёд конформацию линкера; это смещает свободную головку, и она ищет новый сайт стохастически.
• «Один мотор тянет одну везикулу». Часто на везикуле сидят несколько кинезинов и несколько динеинов одновременно - направление определяется балансом.

FAQ

Сколько энергии тратит кинезин на один шаг? Одна молекула ATP на одну головку за шаг $8\ \mathrm{nm}$. В работу против силы $5\ \mathrm{pN}$ уходит $\sim 40\ \mathrm{pN\,nm}$ при доступных $\sim 80\ \mathrm{pN\,nm}$ от ATP - КПД около $50\%$, почти у термодинамического предела.

Почему динеин такой большой, а кинезин маленький? Кинезин-1 - компактный двухголовый мотор с моторным доменом $\sim 40\ \mathrm{kDa}$ на головку. Динеин - гомодимер с тяжёлыми цепями $\sim 530\ \mathrm{kDa}$ и AAA+ кольцом из шести доменов на каждую цепь. Размер связан со способом передачи механического сигнала: у динеина ATP-сайт и место контакта с микротрубочкой разнесены на $\sim 25\ \mathrm{nm}$, и нужна длинная конструкция «кольцо плюс стебель», чтобы передать конформационное изменение.

Зачем динеину нужны динактин и адаптеры? Свободный цитоплазматический динеин почти всегда аутоингибирован в «phi»-конформации и не процессивен. Сборка с динактином и грузовым адаптером (BICD2, HOOK3 и др.) выводит его в открытую активную форму, образует процессивный комплекс и одновременно «выбирает» груз - без адаптера никакой грузовой специфичности нет.

Коротко

Динеин и кинезин - два класса ATP-моторов, шагающих по микротрубочкам в противоположные стороны: кинезин - к плюс-концу, динеин - к минус-концу. Кинезин - компактный двухголовый мотор, шагает по $8\ \mathrm{nm}$ в модели hand-over-hand с одной ATP на головку. Динеин - большой многосубъединичный мотор с AAA+ кольцом, работает только в комплексе с динактином и грузовым адаптером, шаги нерегулярны. Скорости обоих $\sim 1\ \mathrm{\mu m/s}$, силы $\sim 4{-}5\ \mathrm{pN}$. В аксоне эта пара обеспечивает антероградный и ретроградный везикулярный транспорт, в митозе - движение хромосом и расхождение полюсов веретена, в жгутике аксонемальный динеин даёт биение. Поломки моторов и их регуляторов - это длинный список тяжёлых наследственных болезней: KIF5A - спастическая параплегия, BICD2 и SMN - мышечные атрофии, LIS1 - лиссэнцефалия, DNAH5 - цилиарная дискинезия.