Световая и электронная микроскопия

Микроскоп не просто «увеличивает»: он должен раздельно показать две близкие детали. Поэтому большая картинка сама по себе ещё не открывает клеточный мир. Световой прибор позволяет наблюдать живые клетки, окраски и флуоресцентные метки, но упирается в дифракцию. Электронный микроскоп различает намного меньшие структуры, однако работает в вакууме и требует иной подготовки образца. Разберём, откуда берётся предел разрешения, что именно видят разные методы и как выбрать их для учебной или исследовательской задачи.

Увеличение и разрешение: не одно и то же

Увеличение отвечает на вопрос, во сколько раз изображение крупнее объекта. У разрешающей способности другой смысл: это наименьшее расстояние $d$ между двумя точками, которые ещё не сольются в одну. Если бактерию увеличить в тысячу раз, но её контуры остаются размытыми, полезной новой информации не появится. Именно поэтому бессмысленное увеличение называют пустым.

Для оптической микроскопии полезна формула Аббе:

$d = \frac{\lambda}{2NA}, \qquad NA=n\sin\alpha.$

Здесь $\lambda$ - длина волны света, $n$ - показатель преломления среды между препаратом и объективом, а $\alpha$ - половина угла светового конуса, который собирает объектив. Чем короче волна и больше числовая апертура $NA$, тем меньше $d$ и тем лучше различимы детали. При зелёном свете $\lambda \approx 550$ нм и масляном объективе $NA \approx 1{,}4$ получается $d \approx 550/(2\cdot1{,}4) \approx 196$ нм. Отсюда учебная оценка около 200 нм.

Это предел для деталей, а не для положения яркой точки: специальные методы могут локализовать одиночный источник точнее, но не отменяют дифракцию для обычного изображения. О связи длины волны и оптического построения полезно вспомнить в статье о формуле тонкой линзы: она объясняет геометрию изображения, тогда как формула Аббе задаёт предел различения деталей.

Рассчитать для своей задачи

Как устроен световой микроскоп

В классическом световом микроскопе лампа или светодиод освещает препарат через конденсор. Объектив, расположенный ближе всего к образцу, собирает свет и формирует увеличенное промежуточное изображение. Окуляр работает как лупа для этого изображения. Общее увеличение обычно записывают как произведение увеличений объектива и окуляра: объектив $40\times$ вместе с окуляром $10\times$ даёт $400\times$.

Но выбирать объектив нужно не только по числу на оправе. Объектив $100\times$ с масляной иммерсией имеет высокую апертуру, потому что масло уменьшает потерю света на границе стекла и воздуха. Его используют для мелких объектов, например бактерий в окрашенном мазке. Напротив, объектив малого увеличения даёт широкое поле зрения и удобен для поиска участка. Фокусировка перемещает столик или объектив, а диафрагма конденсора регулирует освещение и контраст; слишком закрытая диафрагма может создать впечатление резкости ценой потери деталей.

Что дают светлое поле, фазовый контраст и флуоресценция

В светлом поле окрашенные или естественно поглощающие свет структуры выглядят темнее светлого фона. Это базовый режим для гистологических срезов и бактериальных мазков. Например, после окраски по Граму видно форму и расположение клеток, а итоговый цвет помогает различить две большие группы бактерий.

Прозрачная живая клетка почти не поглощает свет, зато меняет его фазу из-за разной толщины и показателя преломления участков. Фазовый контраст превращает эти фазовые сдвиги в различия яркости. Поэтому можно наблюдать неокрашенные клетки и их движение без агрессивного окрашивания. Контраст не означает, что тёмная область обязательно содержит «больше вещества»: изображение зависит от оптической настройки.

Флуоресцентная микроскопия использует молекулы-метки. Они поглощают свет возбуждения и испускают свет другой, более длинной волны; фильтры отделяют слабый сигнал от яркого возбуждающего света. Так можно увидеть конкретный белок, ядро или мембрану на фоне клетки. Метод хорошо отвечает на вопрос «где находится выбранная молекула», но требует контроля метки, освещения и фотоблекания. Для связи изображения с внутренней организацией прокариот сравните наблюдения с материалом о строении нуклеоида бактерий.

Почему электроны различают более мелкие детали

У движущегося электрона есть длина волны де Бройля $\lambda=h/p$. После ускорения она гораздо короче видимой световой волны, поэтому электронный пучок потенциально способен различать атомные масштабы. Расчёт длины волны через ускоряющее напряжение разобран отдельно в статье о волне де Бройля ускоренного электрона.

Вместо стеклянных линз электронный микроскоп использует электромагнитные линзы, которые фокусируют пучок заряженных частиц. Образец и колонна обычно находятся в вакууме: воздух рассеивал бы электроны. Практическое разрешение ограничивают не только длина волны, но и аберрации линз, устойчивость прибора, толщина препарата, повреждение пучком и качество детектора. Поэтому фраза «разрешение 0,1 нм» - разумная ориентировочная характеристика лучших электронных режимов, а не обещание увидеть любую структуру в любом образце.

ТЭМ: внутреннее строение на ультратонком срезе

В просвечивающем электронном микроскопе (ТЭМ) электроны проходят через тонкий образец. Там, где электроны сильнее рассеиваются или поглощаются, на изображении возникает контраст. ТЭМ применяют для мембран, органелл, вирусов, наночастиц и тонкой внутренней структуры клеток.

Обычный биологический препарат для ТЭМ фиксируют, обезвоживают, заключают в смолу, режут ультрамикротомом на ультратонкие срезы и часто контрастируют соединениями тяжёлых металлов. Типичная толщина среза составляет десятки нанометров; в учебных протоколах часто указывают 50–100 нм. Каждый этап может дать артефакт: усадку, экстракцию липидов или изменение формы. Поэтому ТЭМ-изображение нельзя буквально принимать за нетронутую живую клетку.

СЭМ: рельеф поверхности

В сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) тонкий пучок последовательно обходит поверхность. Детекторы регистрируют вторичные или отражённые электроны, и компьютер строит изображение рельефа. СЭМ особенно нагляден для поверхности насекомого, пыльцы, микротрещин, клеточного слоя или микроструктуры материала. Он не показывает внутренность образца так, как ТЭМ.

Для непроводящих объектов после фиксации и высушивания часто наносят очень тонкое проводящее покрытие, например углерод или металл: без него заряд накапливается и искажает изображение. Это называют напылением. Оно помогает получить стабильный контраст, но ещё раз напоминает, что электронная микроскопия часто исследует подготовленный, а не живой образец.

Рассчитать для своей задачи

КриоЭМ и сохранение структуры в воде

Криоэлектронная микроскопия решает часть проблемы подготовки: образец быстро замораживают так, чтобы вода перешла в стеклообразное состояние, а не образовала разрушающие кристаллы льда. При низкой температуре его наблюдают в электронном микроскопе. Это позволяет изучать биомолекулы в растворе и получать множество проекций частиц для вычислительной реконструкции структуры.

В 2017 году Нобелевскую премию по химии получили Жак Дюбоше, Иоахим Франк и Ричард Хендерсон за развитие криоЭМ для высокоразрешающего определения структур биомолекул в растворе. Метод не делает образец полностью «естественным»: доза электронов ограничена, изображения шумные, а обработка данных критична. Но криоЭМ существенно расширила возможность видеть комплексы, плохо подходящие для кристаллизации.

Сравнение методов

Выбор начинается с вопроса, какую информацию нужно получить: наблюдать живой процесс, найти конкретную метку, увидеть поверхность или различить внутреннюю ультраструктуру. Нельзя сравнивать методы по одному числу разрешения, игнорируя объект и подготовку.

Частые ошибки

1. Путать увеличение с разрешением. Большое число на окуляре не обходит дифракционный предел объектива.
2. Считать 200 нм универсальным числом. Оно зависит от длины волны и числовой апертуры; приведённый пример относится к зелёному свету и масляной иммерсии.
3. Ожидать от СЭМ среза клетки. СЭМ преимущественно даёт информацию о поверхности, а ТЭМ - о просвечиваемой тонкой области.
4. Забывать об артефактах подготовки. Фиксация, обезвоживание, резка и покрытие могут изменить образец.

FAQ

Можно ли увидеть вирус световым микроскопом?

Большинство вирусов меньше примерно 200 нм, поэтому отдельные частицы в обычном световом микроскопе обычно не разрешаются. Наблюдают их действие на клетки, используют специальные оптические методы или электронную микроскопию.

Зачем в световом микроскопе масло?

Иммерсионное масло имеет показатель преломления, близкий к стеклу. Оно повышает числовую апертуру и позволяет объективу собрать больше лучей, а значит уменьшить предел $d$.

Электронная микроскопия всегда даёт изображение в чёрно-белом цвете?

Первичный сигнал электронного микроскопа - интенсивность электронов, поэтому изображение обычно монохромное. Цветные варианты часто добавляют при обработке, чтобы различить области, но это не естественная окраска объекта.

Коротко

Световая микроскопия ограничена дифракцией примерно на уровне 200 нм, зато подходит для живых клеток, окрашивания и флуоресцентных меток. ТЭМ раскрывает внутренние детали тонкого образца, СЭМ - его поверхность, а криоЭМ помогает сохранять гидратированные биомолекулы. Правильный метод выбирают по вопросу к образцу, а не по максимальному увеличению.

Источники

• Nobel Prize: Chemistry 2017
• NCBI Bookshelf: Tools of Cell Biology
• NCBI Bookshelf: Looking at the Structure of Cells in the Microscope