ПЦР: принцип метода и три этапа цикла

Полимеразная цепная реакция - это способ размножить в пробирке один выбранный участок ДНК до количества, которое уже можно увидеть, измерить и прочитать. Метод придумал Кэри Муллис в 1983 году, а Нобелевскую премию за него получил десять лет спустя. Сегодня ПЦР стоит за диагностикой инфекций, установлением отцовства, криминалистической экспертизой, ГМО-контролем и почти любой работой с генами. Принцип ПЦР при этом умещается в одну фразу: нагреть, охладить, дать ферменту достроить цепь - и повторить это тридцать раз. Ниже разберём, что происходит на каждом этапе, откуда берётся экспоненциальный рост и как считают температуру отжига. Собрать разбор конкретной задачи можно прямо в форме ниже.

Что делает ПЦР и зачем это нужно

Задача метода - избирательное копирование. В образце крови, слюны или почвы молекул ДНК немного, и они принадлежат десяткам разных организмов. Нужный ген там есть, но обнаружить его напрямую нельзя: сигнал теряется на фоне всего остального.

ПЦР решает это грубо и красиво. Реакция не очищает нужный фрагмент от чужого - она просто копирует именно его, оставляя остальное в покое. После тридцати циклов доля целевого участка в пробирке вырастает настолько, что вся прочая ДНК становится незначимой примесью. Отсюда и чувствительность метода: теоретически хватает одной молекулы матрицы.

Второе следствие - специфичность. Копируется не «ДНК вообще», а строго тот отрезок, границы которого вы задали сами. Как именно задаются границы, разберём чуть ниже.

Что кладут в пробирку

Реакционная смесь для ПЦР небольшая, обычно 20–50 мкл, и состоит из пяти обязательных компонентов:

• матрица - исследуемая ДНК, в которой есть искомый участок;
• два праймера - короткие одноцепочечные олигонуклеотиды длиной 18–25 звеньев;
• термостабильная ДНК-полимераза - чаще всего фермент из термофильной бактерии Thermus aquaticus;
• смесь четырёх дезоксинуклеотидов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) - строительный материал новых цепей;
• буфер с ионами магния, без которых полимераза не работает.

Рассчитать для своей задачи

Ключевое слово здесь - термостабильная. Обычная ДНК-полимераза человека или кишечной палочки при 95 °C денатурирует за секунды, и в ранних версиях метода фермент приходилось добавлять заново после каждого нагрева. Фермент термофильной бактерии выдерживает кипячение и работает десятки циклов подряд - именно это превратило ПЦР из лабораторной экзотики в рутину и позволило автоматизировать процесс в приборе-термоциклере.

Праймеры задают, какой именно участок размножится

Праймер - короткий фрагмент, комплементарный известной последовательности на матрице. Он выполняет две работы сразу: указывает полимеразе, где начинать синтез, и физически даёт ей свободный 3'-конец, к которому можно присоединять нуклеотиды. Без затравки фермент не начнёт работу - это общее свойство ДНК-полимераз, о котором стоит помнить и в задачах по секвенированию ДНК методом Сэнгера.

Рассчитать для своей задачи

Праймеров два, и они смотрят навстречу друг другу. Прямой праймер комплементарен нижней цепи и запускает синтез вправо, обратный комплементарен верхней и синтезирует влево. Полимераза всегда наращивает цепь в направлении от 5' к 3'-концу, поэтому два встречных старта ограничивают отрезок с двух сторон. Всё, что лежит между праймерами, копируется; всё, что снаружи, - нет.

Именно поэтому продукт реакции называют ампликоном и его длина известна заранее: она равна расстоянию между внешними границами праймеров. Это свойство потом используют для контроля результата.

Три этапа одного цикла

Цикл ПЦР состоит из трёх температурных шагов, и каждый решает свою физико-химическую задачу.

Рассчитать для своей задачи

Денатурация, 94–95 °C, 20–30 секунд. Нагрев разрывает водородные связи между комплементарными основаниями, и двойная спираль расходится на две одиночные цепи. Ковалентные связи внутри цепи при этом целы - рвётся только сцепка между ними, подчиняющаяся правилам комплементарности Чаргаффа. Участки, богатые парами Г-Ц с тремя водородными связями, расходятся тяжелее, чем богатые А-Т с двумя.

Отжиг, 50–65 °C, 20–40 секунд. Температуру резко снижают, и праймеры садятся на комплементарные им места. Праймеры короткие, их в смеси огромный избыток, поэтому они находят свою мишень быстрее, чем длинные материнские цепи успевают снова слипнуться друг с другом.

Элонгация, 72 °C, около минуты на тысячу пар оснований. Это температурный оптимум термостабильной полимеразы. Фермент садится на комплекс праймер-матрица и достраивает вторую цепь, присоединяя нуклеотиды по принципу комплементарности. Скорость синтеза - порядка тысячи оснований в минуту, отсюда и правило расчёта времени шага.

После элонгации смесь снова нагревают, и цикл повторяется. Обычно делают 25–40 циклов.

Почему рост числа копий экспоненциальный

В идеале за один цикл каждая двухцепочечная молекула превращается в две. Число копий описывается формулой

$N = N_0 \cdot 2^{\,n}$

где $N_0$ - исходное число молекул матрицы, $n$ - число циклов. Для одной молекулы и 30 циклов получаем $2^{30} \approx 1{,}07 \cdot 10^{9}$ - больше миллиарда копий. Это и есть «цепная» часть названия: продукт каждого цикла становится матрицей для следующего.

Реальная реакция идёт хуже идеальной, поэтому на практике пользуются формулой с эффективностью:

$N = N_0 \cdot (1 + E)^{\,n}, \qquad 0 < E \le 1$

При $E = 1$ удвоение полное, при $E = 0{,}9$ - за цикл прибавляется 90 %. Разница кажется мелкой, но за 30 циклов она даёт падение выхода примерно в 16 раз. В количественной ПЦР эффективность оценивают по калибровочной кривой, и значения ниже 0,8 считают поводом переделать подбор праймеров.

Важно, что экспонента работает не бесконечно. Когда нуклеотиды и праймеры израсходованы, а продукта становится так много, что цепи слипаются друг с другом быстрее, чем с праймерами, рост выходит на плато. Поэтому по конечному количеству продукта нельзя судить о том, сколько матрицы было вначале, - для этого нужна ПЦР в реальном времени, где сигнал измеряют на каждом цикле.

Температура отжига: главный настраиваемый параметр

Отжиг - единственный шаг, температуру которого подбирают под конкретную пару праймеров. Ориентир - температура плавления праймера $T_m$, при которой половина дуплексов расходится. Для коротких олигонуклеотидов её оценивают по правилу Уоллеса:

$T_m = 2 \cdot (A + T) + 4 \cdot (G + C)$

где буквы обозначают количество соответствующих оснований в праймере. Рабочую температуру отжига берут на несколько градусов ниже:

$T_a \approx T_m - 5\ ^{\circ}\text{C}$

Логика подбора простая. Слишком низкая температура отжига - праймер садится и на неполностью комплементарные места, в геле появляются лишние полосы и димеры праймеров. Слишком высокая - праймер не удерживается нигде, продукта нет вовсе. Хорошая пара праймеров имеет близкие $T_m$ (расхождение не больше 2–3 °C), долю Г-Ц около 40–60 % и не образует шпилек сама с собой.

Как понимают, что реакция удалась

Классический контроль - разделение продукта в агарозном геле. Ампликон известной длины даёт одну чёткую полосу, положение которой сравнивают с маркером молекулярных масс; подробнее о том, как читают такой результат, - в разборе электрофореза ДНК. Смазанная дорожка или несколько полос означают неспецифический отжиг.

Обязательны два контроля: отрицательный (смесь без матрицы - проверка на загрязнение) и положительный (заведомо работающая матрица - проверка, что реактивы живы).

Частые ошибки

• Путают денатурацию с разрушением ДНК. При 95 °C рвутся только водородные связи между цепями, сами цепи остаются целыми.
• Считают, что праймер «ищет» ген. Праймер не узнаёт ген как объект - он просто комплементарен конкретной последовательности, и его нужно спроектировать по известному тексту генома.
• Забывают, что праймеров два и они встречные. С одним праймером получится линейное накопление копий, а не экспоненциальное.
• Берут температуру отжига равной $T_m$. Рабочая температура ниже на 3–5 °C, иначе выход резко падает.
• Судят о количестве исходной ДНК по яркости полосы в геле. Реакция выходит на плато, и на конечной точке разные стартовые количества дают одинаковый сигнал.

FAQ

Чем ПЦР отличается от ОТ-ПЦР? В обратной транскрипции с ПЦР (ОТ-ПЦР) исходный материал - РНК. Сначала фермент обратная транскриптаза делает с неё комплементарную ДНК, и уже эта кДНК идёт в обычную реакцию. Так работают тесты на РНК-вирусы и анализ экспрессии генов.

Что такое ПЦР в реальном времени? Это тот же принцип, но с флуоресцентной меткой: прибор измеряет свечение после каждого цикла. Номер цикла, на котором сигнал превысил порог, зависит от исходного количества матрицы, поэтому метод даёт количественный результат, а гель не нужен.

Почему хватает одной молекулы ДНК? Из-за экспоненциального роста: за 30 циклов одна молекула даёт порядка $10^9$ копий. Обратная сторона такой чувствительности - риск загрязнения: попавшая в пробирку чужая ДНК размножится с той же лёгкостью, поэтому пробоподготовку и постановку реакции разносят по разным помещениям.

Коротко

Принцип ПЦР - циклическое копирование участка ДНК, границы которого заданы парой встречных праймеров. Каждый цикл состоит из денатурации при 95 °C, отжига праймеров при 50–65 °C и элонгации при 72 °C силами термостабильной полимеразы; продукт цикла служит матрицей для следующего, поэтому число копий растёт как $N_0 (1+E)^n$ и за 30 циклов достигает миллиарда. Настраивают в реакции в основном температуру отжига (по $T_m$ праймеров) и время элонгации (по длине ампликона), а результат проверяют электрофорезом с обязательными положительным и отрицательным контролями.