Метод пэтч-кламп: как записать ток одного ионного канала

Метод пэтч-кламп (от английского patch clamp, «фиксация участка») позволяет увидеть работу одной белковой молекулы в реальном времени: стеклянная микропипетка присасывается к мембране клетки, изолирует крошечный участок с одним или несколькими ионными каналами, и усилитель регистрирует ток в единицы пикоампер. Метод придумали Эрвин Неер и Берт Закман в 1976 году, а в 1991 году он принёс им Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Ниже разберём, откуда берётся гигаомный контакт, чем отличаются четыре конфигурации записи и что именно измеряют. Калькулятор сразу под этим абзацем считает ток одиночного канала, ток целой клетки и шум контакта, а заодно рисует модельную запись со ступеньками открытия.

Что такое метод пэтч-кламп

До 1976 года электрофизиология умела мерить только суммарный ток тысяч каналов. Классическая фиксация потенциала на гигантском аксоне кальмара (как её использовали Ходжкин и Хаксли, разобрано в статье про модель Ходжкина-Хаксли) требовала вводить в клетку проволочный электрод и давала макроскопический ток. Что каналы открываются дискретно, по принципу «всё или ничего», оставалось гипотезой.

Неер и Закман прижали к мембране денервированного мышечного волокна лягушки пипетку с кончиком около микрометра и впервые записали прямоугольные ступеньки тока через каналы, активируемые ацетилхолином. Сопротивление контакта тогда составляло десятки мегаом, и шум почти скрывал сигнал. Прорыв случился в 1980-1981 годах: группа Неера обнаружила, что лёгкий отсос на чистой мембране даёт контакт в гигаомы, и описала четыре конфигурации записи, которыми пользуются до сих пор.

Суть метода в одной фразе: электрически изолировать маленький участок мембраны и держать на нём заданный потенциал (или ток), измеряя то, что через него проходит.

Микропипетка и гигаомный контакт

Пипетку вытягивают из боросиликатного стекла на специальном пуллере, кончик оплавляют, чтобы края стали гладкими. Диаметр отверстия около 1 мкм, сопротивление заполненной пипетки обычно 2-10 МОм. Внутри раствор, имитирующий цитоплазму или межклеточную жидкость, и хлорсеребряный электрод.

Рассчитать для своей задачи

Пипетку подводят к клетке, касаются мембраны и слегка подсасывают. Липиды прилипают к стеклу, и сопротивление между раствором пипетки и ванной скачком вырастает до 1-100 ГОм. Это и есть гигаомный контакт (gigaseal). Он решает две задачи сразу: механически фиксирует участок и не даёт току утекать в обход канала.

Зачем именно гигаомы, видно из формулы теплового шума сопротивления:

$\sigma = \sqrt{\frac{4kT\,\Delta f}{R_{seal}}}$

где $k$ постоянная Больцмана, $T$ температура, $\Delta f$ полоса пропускания фильтра, $R_{seal}$ сопротивление контакта. При 22 °C и полосе 1 кГц контакт в 10 ГОм даёт $\sigma \approx 0{,}040$ пА, в 1 ГОм примерно 0,128 пА, а рыхлый контакт в 0,1 ГОм уже 0,40 пА. Если ток канала 2,8 пА, отношение сигнал/шум падает с 69 до 7. Это нижняя граница: реальный шум выше за счёт усилителя и ёмкости пипетки, но зависимость от $R_{seal}$ сохраняется. Переключите сопротивление контакта в калькуляторе, и ступеньки на модельной записи начнут тонуть в шуме.

Четыре конфигурации: cell-attached, whole-cell, inside-out, outside-out

Из одного и того же контакта получают четыре режима записи. Переход между ними делается отсосом или отведением пипетки.

Рассчитать для своей задачи

• Cell-attached (на клетке). Пипетка просто присосана, мембрана цела. Записываются токи каналов под кончиком, а внутренняя среда клетки не нарушена. Минус: мембранный потенциал клетки неизвестен точно, задаётся только разность относительно него.
• Whole-cell (целая клетка). Коротким импульсом отсоса участок под кончиком прорывают, и пипетка сообщается с цитоплазмой. Регистрируется суммарный ток всех каналов клетки. Раствор пипетки за минуты вымывает содержимое цитоплазмы (диализ).
• Inside-out (изнутри наружу). Из режима cell-attached пипетку резко отводят, и участок мембраны отрывается внутренней стороной к раствору ванны. Удобно менять внутриклеточные факторы: кальций, АТФ, вторичные посредники.
• Outside-out (снаружи наружу). Из режима whole-cell пипетку медленно отводят, мембрана смыкается на кончике внешней стороной к ванне. Удобно подавать лиганды и лекарства снаружи.

Отдельно стоит перфорированный пэтч: в пипетку добавляют антибиотик (нистатин, амфотерицин, грамицидин), который делает в участке мембраны мелкие поры. Электрический доступ как в whole-cell, но крупные молекулы цитоплазмы не вымываются.

Фиксация напряжения и фиксация тока

Усилитель пэтч-кламп работает в двух режимах. При фиксации напряжения (voltage clamp) цепь обратной связи держит потенциал на заданном уровне и подаёт ровно такой ток, какой протекает через каналы. Этот компенсирующий ток и записывают. Так снимают ступеньки одиночных каналов и вольт-амперные кривые.

При фиксации тока (current clamp) задают инжектируемый ток (часто нулевой) и записывают мембранный потенциал. В режиме whole-cell это прямой способ увидеть потенциал покоя и потенциалы действия нейрона, в том числе в срезах мозга. Проверить, согласуется ли измеренный потенциал покоя с ионными градиентами, можно по уравнению Голдмана-Ходжкина-Катца.

Токи одиночных каналов: проводимость и вероятность открытия

Запись одиночного канала выглядит как телеграфный сигнал: ток скачет между нулём (канал закрыт) и постоянным уровнем $i$ (канал открыт). Из такой записи извлекают три величины.

Проводимость. Амплитуда ступеньки подчиняется закону Ома с поправкой на движущую силу:

$i = \gamma\,(V - E_{rev})$

где $\gamma$ проводимость одиночного канала, $V$ потенциал фиксации, $E_{rev}$ потенциал реверсии, при котором ток меняет знак. Если при $V = -70$ мВ и $E_{rev} = 0$ мВ ступенька равна $-2{,}8$ пА, то $\gamma = 2{,}8 / 70 = 0{,}040$ нС, то есть 40 пС. Проводимости каналов лежат в диапазоне от единиц до сотен пикосименс. Наклон вольт-амперной прямой в калькуляторе и есть $\gamma$, а точка пересечения с нулём показывает $E_{rev}$ и, значит, селективность канала (сравните с потенциалом Нернста из статьи про потенциал покоя).

Вероятность открытия $P_o$ равна доле времени, которую канал проводит в открытом состоянии. По ней судят, как на канал действуют потенциал, лиганд или лекарство.

Кинетика: гистограммы времён открытого и закрытого состояний показывают, сколько состояний у канала и с какими скоростями он между ними переходит.

Микро- и макроуровень связывает простое соотношение:

$I = N\,P_o\,i$

При $N = 1000$ каналов, $P_o = 0{,}30$ и $i = -2{,}8$ пА ток целой клетки равен $-840$ пА. Именно поэтому один метод отвечает на вопросы обоих уровней. Как три состояния натриевого канала проявляются в таких записях, разобрано в статье про потенциал-зависимые натриевые каналы.

Кроме токов, в режиме whole-cell измеряют ёмкость мембраны: при слиянии секреторных пузырьков с мембраной она растёт скачками по несколько фемтофарад. Так Неер изучал экзоцитоз.

Автоматический пэтч-кламп в фармакологии

Ручная запись требует микроскопа, манипулятора и опытного оператора, за день получается несколько десятков клеток. Для скрининга лекарств этого мало, поэтому появились автоматические установки. Вместо пипетки в них плоский чип с отверстием около микрометра: клетки из суспензии подсасываются к отверстиям, и контакт формируется без участия человека, параллельно в десятках или сотнях лунок.

Главное применение связано с безопасностью. Блокада калиевого канала hERG удлиняет интервал QT и может вызвать опасную аритмию, поэтому каждый кандидат в лекарства проверяют на этот канал. Автоматический пэтч-кламп также применяют для поиска блокаторов натриевых каналов при боли и эпилепсии и для исследования мутаций при каналопатиях.

Ограничения метода

• Последовательное сопротивление. В whole-cell ток идёт через кончик пипетки с сопротивлением доступа $R_s$, и реальный потенциал отличается от командного на $I R_s$. При токе 840 пА и $R_s = 10$ МОм ошибка составляет 8,4 мВ, поэтому $R_s$ компенсируют электроникой.
• Пространственная фиксация. В нейроне с длинными дендритами потенциал удаётся удержать только рядом с сомой, быстрые токи на периферии искажаются.
• Диализ и затухание токов. Вымывание цитоплазмы уносит регуляторные молекулы, и токи ослабевают за минуты.
• Инвазивность и доступность. Нужна чистая мембрана, крупные ткани требуют срезов или диссоциации клеток, запись в живом организме возможна, но трудна.
• Производительность. Ручной метод медленный, автоматический теряет гибкость выбора конкретной клетки.

Частые ошибки

• Путать пэтч-кламп с классической фиксацией потенциала: в методе Ходжкина-Хаксли электрод вводили внутрь аксона, здесь пипетка прилегает снаружи и изолирует участок.
• Считать, что гигаомный контакт нужен для прочности. Главное в нём электрическая изоляция и низкий шум.
• Писать закон Ома без движущей силы: $i = \gamma V$ верно только при $E_{rev} = 0$.
• Путать inside-out и outside-out: название говорит, какая сторона мембраны обращена к ванне.
• Забывать, что в cell-attached известен лишь потенциал относительно покоя клетки.

FAQ

Кто изобрёл метод пэтч-кламп? Эрвин Неер и Берт Закман, первая публикация 1976 года. В 1991 году они получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за открытия, касающиеся функции одиночных ионных каналов.

Какой ток регистрируют в пэтч-кламп? Токи одиночных каналов составляют доли и единицы пикоампер, иногда до двадцати. Ток целой клетки обычно от сотен пикоампер до нескольких наноампер.

Чем whole-cell отличается от cell-attached? В cell-attached мембрана цела и регистрируются каналы только под кончиком. В whole-cell участок прорван, пипетка сообщается с цитоплазмой, и записывается ток всей клетки или её потенциал.

Коротко

Метод пэтч-кламп изолирует микропипеткой участок мембраны за счёт гигаомного контакта, который снижает шум до сотых долей пикоампера и делает видимыми токи одиночных каналов. Четыре конфигурации (cell-attached, whole-cell, inside-out, outside-out) выбирают в зависимости от того, к какой стороне мембраны нужен доступ и что регистрируется: одиночные каналы или вся клетка. В режиме фиксации напряжения меряют ток, в режиме фиксации тока меряют потенциал. Из записей получают проводимость $\gamma$ по формуле $i = \gamma(V - E_{rev})$, вероятность открытия $P_o$ и кинетику, а соотношение $I = N P_o i$ связывает их с током клетки. Автоматический пэтч-кламп стал стандартом проверки лекарств на канал hERG. Главные ограничения метода: ошибка последовательного сопротивления, неполная пространственная фиксация и диализ цитоплазмы.