Соматическая гибридизация клеток: методы и применение

Соматическая гибридизация клеток - это искусственное слияние двух клеток, не связанное с оплодотворением. У обычной гибридизации встречаются гаметы и объединяются два гаплоидных набора хромосом. Здесь экспериментатор заставляет соприкоснуться и слиться соматические клетки: их мембраны становятся общей оболочкой, а содержимое оказывается в одном объёме. Так получают модель для изучения регуляции генов, линию для производства антител или растительную клетку с необычным сочетанием ядер и органелл. Главное в ответе на экзамене - разделять временный продукт слияния и устойчивый делящийся гибрид.

Что происходит после слияния клеток

Клетки сначала сближают, затем локально нарушают упорядоченность липидных мембран. Возникает одна клетка с цитоплазмой обоих родителей. Если ядра ещё раздельны, это гетерокарион: в общей цитоплазме находятся два или несколько ядер. Он особенно удобен, когда нужно быстро увидеть, как белки и регуляторные факторы одного ядра влияют на другое.

Позже ядра могут слиться либо клетка начнёт делиться так, что сформируется потомство с объединённым генетическим материалом. Такой клон называют соматическим гибридом. Это не обязательно «половина одного организма и половина другого»: при делениях хромосомы могут теряться, а состав клеток популяции приходится отдельно проверять кариотипированием, маркерами или анализом ДНК. Не путайте процесс с митозом и мейозом: слияние соединяет уже готовые клетки, а не распределяет хромосомы между дочерними клетками.

Рассчитать для своей задачи

Чем вызывают слияние: Сендай, ПЭГ и электричество

Классический биологический фузоген - инактивированный вирус Сендай. Его поверхностные белки умеют связываться с мембранами и сближать их; после инактивации вирус не должен размножаться, но сохраняет способность запускать слияние. Метод исторически важен, однако в современных учебных схемах чаще сопоставляют химический и электрический подходы.

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) - водорастворимый полимер, который временно меняет свойства поверхности клеток, облегчает их тесный контакт и слияние мембран. Он относительно прост для работы с суспензией клеток, но режим подбирают бережно: слишком жёсткая обработка повреждает клетки. Электрослияние строится в два этапа: переменное поле выстраивает клетки цепочкой между электродами, а короткий импульс создаёт в мембране обратимые поры и запускает её слияние. Метод даёт управляемый контакт отдельных клеток, но требует специальной камеры и настройки импульса.

После любого способа остаётся задача отбора. В смеси присутствуют несросшиеся родительские клетки, клетки одного и того же родителя, случайно слившиеся пары и лишь часть нужных гибридов. Поэтому в опыт заранее закладывают различимые признаки: разные метаболические дефекты, устойчивость к селективной среде, флуоресцентные метки или особенности хромосом. Затем кандидата не называют гибридом только по внешнему виду: его клонируют, проверяют маркеры обоих родителей и оценивают, сохраняется ли признак после нескольких пассажей. В случае гибридомы отбор дополнительно отделяет клетки, которые выжили, от тех, которые ещё и секретируют антитело нужной специфичности. Эта последовательность «слияние - селекция - клональная проверка» важнее запоминания одного названия реагента.

Полезно также различать эффективность слияния и выход пригодных гибридов. Первая величина отвечает на вопрос, сколько клеток физически объединилось после обработки. Вторая гораздо строже: сколько из них пережило восстановление мембраны, сохранило нужные признаки и дало растущий клон. Высокая доля слитых клеток ещё не гарантирует хороший эксперимент. Контроль без фузогена, контроль с каждым родителем по отдельности и независимое подтверждение маркеров позволяют не принять случайную смесь за результат гибридизации.

Почему растительным клеткам сначала снимают стенку

Растительную клетку нельзя просто прижать к соседней: между плазматическими мембранами лежат прочные клеточные стенки. Поэтому из листа или другой ткани ферментами получают протопласты - живые клетки без стенки. Обычно используют смеси, разрушающие целлюлозный и пектиновый каркас; осмотически сбалансированная среда не даёт протопласту лопнуть.

После обработки ПЭГ или электрослияния можно получить симметричный гибрид с вкладом обоих родителей. Если стараются сохранить ядро одного родителя, но передать цитоплазму, митохондрии или пластиды другого, говорят об асимметричном гибриде или цибриде. Следующая трудная ступень - не само слияние, а регенерация целого растения из отобранной клетки. Поэтому «помидофель» часто показывают как курьёз: прививка томата и картофеля даёт два типа плодов на одном растении, но не является соматическим гибридом и не создаёт единый геном томата с картофелем.

Рассчитать для своей задачи

Как гибриды мышь × человек помогали картировать гены

В клеточной культуре удаётся слить, например, мышиную и человеческую клетку. Первоначально гибрид содержит хромосомы обоих видов, но при последующих делениях человеческие хромосомы обычно теряются не все сразу и не одинаково в разных линиях. Исследователь получает панель клонов: в одном осталась человеческая хромосома 7, в другом - 12, в третьем - фрагмент хромосомы.

Дальше ищут связь между признаком и сохраняющейся хромосомой. Если человеческий белок или последовательность ДНК обнаруживается только в тех линиях, где есть определённая хромосома, ген локализуют на ней. Это был один из ранних методов картирования генов человека; он объясняет, почему потеря хромосом здесь не помеха, а источник информации. Структурные перестройки нужно отличать от хромосомных аберраций: в гибридной панели утрата часто используется как экспериментальная переменная, а не служит диагнозом повреждения.

Гибридома: фабрика одного антитела

Иммунная система даёт B-лимфоцит с нужной специфичностью, но такая клетка плохо живёт в культуре. Клетка миеломы, напротив, может делиться долго, но сама по себе не несёт нужного антитела. При слиянии получают гибридому, объединяющую оба полезных свойства: продукцию заданного антитела и практически неограниченное размножение. После отбора выбирают один клон, проверяют его специфичность и выращивают культуру.

Жорж Кёлер и Сезар Мильштейн описали непрерывные культуры слитых клеток, секретирующих антитело заданной специфичности, в 1975 году. За принцип получения моноклональных антител они вместе с Нильсом Ерне получили Нобелевскую премию по физиологии или медицине 1984 года. «Моноклональное» означает происхождение от одного клеточного клона, а не неизменность любой молекулы на свете. Связать этот результат с устройством продукта помогут материалы о классах иммуноглобулинов и о плазмоцитах: гибридома использует секреторную программу B-клеточной линии, но не является нормальной клеткой организма.

Где метод применяют и где его границы

Слияние клеток не заменяет ни направленное редактирование ДНК, ни селекцию. Оно переносит сразу много наследственного материала, поэтому результат может быть полезен, но сложен для предсказания. Для растений особенно критична способность конкретного вида восстановиться из протопласта; для животных клеток - жизнеспособность, стабильность кариотипа и корректный отбор гибрида. Сходная логика отбора клеточного клона встречается в генной инженерии, но там конструируют и вводят определённую ДНК, а не соединяют два клеточных содержимых.

Частые ошибки

• Называть любой продукт слияния гибридом. Пока в общей цитоплазме лежат раздельные ядра, перед вами гетерокарион; устойчивый гибрид должен пережить деления и быть охарактеризован.
• Считать ПЭГ генетическим редактором. Он помогает мембранам слиться, но не выбирает гены и не «склеивает» ДНК по заданному плану.
• Принимать привитый помидофель за межвидовой гибрид. У прививки ткани подвоя и привоя остаются разными; клетки не образуют единый гибридный клон.
• Думать, что гибридома производит все антитела сразу. Отбирают один клон с одной требуемой специфичностью.

FAQ

Чем гетерокарион отличается от синкариона? В гетерокарионе ядра в общей цитоплазме раздельны. Синкарион - стадия после их слияния в одно ядро; из него может развиться стабильная гибридная линия.

Можно ли получить соматический гибрид двух любых растений? Нет. Слить протопласты иногда удаётся, но ещё нужно отобрать жизнеспособную клетку и регенерировать из неё растение; это сильно зависит от вида и протокола.

Почему для гибридомы берут миеломную клетку? Она обеспечивает способность долго делиться в культуре, тогда как B-лимфоцит приносит специфичность антитела. Отбор оставляет именно слитые клетки.

Коротко

Соматическая гибридизация объединяет клетки, а не гаметы. Вирус Сендай, ПЭГ и электрослияние создают общий цитоплазматический объём; сначала часто возникает гетерокарион, а после стабилизации - гибридный клон. Протопласты растений получают ферментативным снятием стенки, межвидовые гибриды мышь × человек использовали для картирования генов по утрате человеческих хромосом, а гибридомы сделали возможным получение моноклональных антител. Метод широк по возможностям, но требует проверки жизнеспособности, состава хромосом и свойств каждого выбранного клона.