Хромосомные аберрации: типы, учёт и дозовая кривая

Хромосомные аберрации - это видимые в световой микроскоп нарушения структуры или числа хромосом, которые цитогенетик не столько описывает словами, сколько считает. Лаборатория берёт культуру лимфоцитов, останавливает деление на стадии метафазы и перебирает пластинку за пластинкой: сколько дицентриков, сколько колец, сколько ацентрических фрагментов приходится на сотню клеток. Из этих цифр вырастает и клинический диагноз, и оценка поглощённой дозы облучения. Счётчик ниже переводит результаты такого подсчёта в частоту аберраций и в дозу по стандартной калибровочной кривой.

Что такое хромосомные аберрации

Аберрация - это перестройка, различимая на уровне целой хромосомы, а не отдельного нуклеотида. Нижний порог разрешения обычного G-окрашивания составляет примерно 5-10 миллионов пар оснований, поэтому точечная замена или сдвиг рамки считывания в аберрацию не превращаются: генные мутации живут на два-три порядка ниже по масштабу и требуют секвенирования. Верхняя граница термина шире, чем кажется: к аберрациям относят и структурные перестройки, и числовые нарушения кариотипа.

Причина почти любой структурной аберрации одна - двунитевой разрыв ДНК, который клетка не отремонтировала или отремонтировала неправильно. Ионизирующее излучение создаёт такие разрывы напрямую и через радикалы воды, химические мутагены - через аддукты и блокировку топоизомераз. Если в ядре одновременно оказались два свободных конца от разных разрывов, система негомологичного соединения концов может сшить их «крест-накрест», и в кариотипе появляется новая конфигурация. Механику отдельных перестроек - делеций, дупликаций, инверсий, транслокаций - подробно разбирает статья про хромосомные мутации, здесь же важнее, как аберрации классифицируют и считают.

Хромосомный и хроматидный тип: метка времени

Первая ось классификации отвечает не на вопрос «что сломалось», а на вопрос «когда». Если повреждающий агент подействовал в фазе $G_0$ или $G_1$, то есть до репликации, разрыв копируется в обе сестринские хроматиды. В метафазе он виден как симметричное нарушение обеих нитей - это аберрация хромосомного типа: дицентрик, центрическое кольцо, парный ацентрический фрагмент.

Если же воздействие пришлось на фазу $S$ или $G_2$, когда часть хромосомы уже удвоена, повреждается только одна хроматида. В метафазе наблюдают одиночный фрагмент, хроматидный разрыв или хроматидный обмен - аберрацию хроматидного типа.

Рассчитать для своей задачи

Практический вывод: радиация в покоящихся лимфоцитах крови почти всегда даёт аберрации хромосомного типа, а преобладание хроматидных повреждений указывает на химический агент или на воздействие уже во время культивирования.

Обменные и необменные перестройки

Вторая ось - участвовали ли в событии два разрыва или один. Необменные аберрации возникают из одного разрыва: концевая делеция даёт ацентрический фрагмент, который в следующем митозе просто теряется, потому что у него нет центромеры и веретено не может его растащить.

Обменные аберрации требуют минимум двух разрывов и неправильного воссоединения концов. Классические варианты:

• дицентрик - слияние двух центромерных участков разных хромосом; сопровождается парным ацентрическим фрагментом;
• центрическое кольцо - два разрыва в одной хромосоме по обе стороны от центромеры и замыкание концов;
• реципрокная транслокация - взаимный обмен фрагментами между негомологичными хромосомами без потери материала;
• инсерция - вставка внутреннего участка одной хромосомы в другую.

Отдельно отмечают ацентрические кольца и хроматидные обмены типа трирадиала. Ключевая деталь для подсчёта: фрагмент, сопутствующий дицентрику или кольцу, отдельной аберрацией не считают - он часть одного события.

Нестабильные и стабильные аберрации

Судьба аберрации в ряду клеточных делений определяет, что именно можно по ней узнать. Дицентрик с двумя центромерами тянется к разным полюсам, образует мост в анафазе и рвётся; клетка с ним чаще всего погибает или теряет материал. Такие перестройки называют нестабильными, и их частота убывает со временем: период полуубывания дицентриков в лимфоцитах человека составляет около трёх лет.

Рассчитать для своей задачи

Реципрокная транслокация, наоборот, сбалансирована: материал не утрачен, митоз проходит нормально, клон живёт десятилетиями. Стабильные аберрации не видны при обычном окрашивании, зато прекрасно выявляются методом FISH с покраской отдельных хромосом. Поэтому свежее облучение оценивают по дицентрикам, а событие двадцатилетней давности - по транслокациям.

Числовые аберрации кариотипа

Кроме структурных перестроек в понятие входят нарушения числа хромосом. Анеуплоидия - изменение числа отдельных хромосом: трисомия 21 (синдром Дауна, кариотип 47,XX,+21), моносомия X (45,X, синдром Шерешевского-Тёрнера), 47,XXY при синдроме Клайнфельтера. Причина - нерасхождение хромосом в мейозе или митозе.

Полиплоидия - кратное увеличение всего набора (триплоидия 69,XXX). У человека она летальна, у растений лежит в основе селекции. Мозаицизм означает, что аберрантный клон соседствует с нормальным: запись 46,XX/45,X читается как две клеточные линии в одном организме.

Как считают частоту аберраций

Стандартный протокол метафазного анализа: культивирование лимфоцитов 48 часов с фитогемагглютинином, остановка митоза колцемидом, гипотоническая обработка раствором KCl, фиксация смесью Карнуа, окраска по Гимзе. Затем анализируют метафазы с полным набором из 46 центромер.

Рассчитать для своей задачи

Частоту выражают на 100 клеток:

$$F = \frac{N_{\text{аб}}}{N_{\text{кл}}} \cdot 100$$

где $N_{\text{аб}}$ - число зарегистрированных аберраций, $N_{\text{кл}}$ - число проанализированных метафаз. Отдельно указывают долю аберрантных клеток: в одной пластинке может быть две и три перестройки. Спонтанный уровень у здорового взрослого - 1-2 аберрантные клетки на 100, дицентрики встречаются примерно в одной клетке из тысячи. Быстрая альтернатива - микроядерный тест с цитохалазином B: считают микроядра в двуядерных клетках, чувствительность ниже, зато анализ проще автоматизировать.

Дозовая кривая: аберрации как дозиметр

Выход дицентриков на редкоионизирующее излучение описывает линейно-квадратичная модель:

$$Y = C + \alpha D + \beta D^{2}$$

Здесь $Y$ - число дицентриков на клетку, $D$ - доза в греях, $C$ - спонтанный фон (порядка $10^{-3}$), а коэффициенты для гамма-излучения ${}^{60}\mathrm{Co}$ обычно лежат около $\alpha \approx 0{,}02$ Гр$^{-1}$ и $\beta \approx 0{,}06$ Гр$^{-2}$. Линейный член отвечает за разрывы от одного трека частицы, квадратичный - за парные разрывы от двух независимых треков, поэтому при малых дозах кривая почти прямая, а при больших круто загибается вверх.

Обратная задача, ради которой всё и затевается, решается через дискриминант квадратного уравнения:

$$D = \frac{-\alpha + \sqrt{\alpha^{2} + 4\beta\,(Y - C)}}{2\beta}$$

Запись по номенклатуре ISCN

Кариотип описывают по международной системе ISCN: сначала общее число хромосом, затем половые, затем аберрации. Запись 46,XY,t(9;22)(q34;q11) означает нормальное число хромосом и реципрокную транслокацию между 9-й и 22-й (филадельфийская хромосома при хроническом миелолейкозе). Запись 46,XX,del(5)(p15) - делеция короткого плеча пятой хромосомы, синдром кошачьего крика. Для дицентрика используют символ dic, для кольца - r, для инверсии - inv.

Частые ошибки

• Путают аберрацию и генную мутацию. Замена одного нуклеотида в микроскоп не видна, аберрация - это событие мегабазного масштаба.
• Считают сопутствующий фрагмент отдельной аберрацией. Дицентрик и его парный ацентрик - одно событие, иначе частота завышается вдвое.
• Оценивают давнее облучение по дицентрикам. Через десять лет их почти не осталось; для ретроспективы нужны стабильные транслокации и FISH.
• Забывают вычесть спонтанный фон $C$ при расчёте дозы, из-за чего при малых воздействиях получают ненулевую дозу на пустом месте.
• Анализируют слишком мало метафаз. Для доз ниже 0,3 Гр нужны сотни, а иногда и тысячи клеток, иначе доверительный интервал перекрывает ноль.

FAQ

Чем хромосомные аберрации отличаются от хромосомных мутаций? Термины пересекаются. Мутация - наследуемое изменение генетического материала, аберрация - цитогенетически видимое нарушение, в том числе в соматической клетке, которое потомству не передаётся. Числовые нарушения кариотипа традиционно относят к геномным мутациям, но в аберрации их включают.

Сколько клеток нужно проанализировать? В клинической цитогенетике для исключения мозаицизма обычно смотрят 20-30 метафаз. В биодозиметрии при подозрении на дозу выше 1 Гр хватает 50 клеток, а при малых дозах требуется 500-1000, потому что искомый сигнал сопоставим со спонтанным фоном.

Почему дицентрик считают маркером именно радиации? Спонтанно он возникает крайне редко и требует двух одновременных разрывов в разных хромосомах, сближенных в пространстве. Такое сочетание почти всегда даёт трек ионизирующей частицы, а не химический агент, поэтому дицентрик и стал «золотым стандартом» биологической дозиметрии.

Коротко

Хромосомные аберрации - это перестройки и числовые нарушения кариотипа, различимые в микроскоп. По времени воздействия их делят на хромосомный и хроматидный тип, по механизму - на обменные и необменные, по судьбе в делениях - на нестабильные (дицентрики, кольца, фрагменты) и стабильные (транслокации, инверсии). Частоту выражают числом аберраций на 100 проанализированных метафаз, а выход дицентриков через линейно-квадратичную зависимость $Y = C + \alpha D + \beta D^{2}$ переводят в оценку поглощённой дозы.