Методы культивирования анаэробных бактерий в лаборатории

Культивирование анаэробных бактерий - одна из наиболее технически требовательных задач в микробиологии. Даже кратковременный контакт с кислородом воздуха губителен для строгих анаэробов, поэтому каждый этап - от приготовления питательной среды до посева и инкубации - требует специального оборудования и чётких протоколов. Без понимания принципов создания и поддержания бескислородной атмосферы невозможно выделить сульфатредуцирующие бактерии, клостридии или метаногены в чистую культуру. Выбрать метод, подходящий для конкретной группы организмов, поможет инструмент ниже.

Классификация анаэробов по чувствительности к кислороду

Прежде чем выбирать метод, важно понять, с каким типом анаэроба вы работаете: требования к кислороду у разных групп принципиально различаются.

Факультативные анаэробы (например, Escherichia coli, Staphylococcus aureus) растут как в присутствии, так и в отсутствие кислорода - для них достаточно обычной питательной среды с добавлением анаэробных условий при необходимости.

Аэротолерантные анаэробы (Lactobacillus, Streptococcus) переносят кислород, не используя его для роста. Им подходят плотные среды без специальной атмосферы.

Умеренные анаэробы выдерживают кратковременный контакт с кислородом при комнатной температуре, но в итоге требуют его удаления. Сюда относятся Bacteroides fragilis и многие Fusobacterium.

Строгие (облигатные) анаэробы - клостридии, сульфатредуцирующие бактерии, метаногены - гибнут даже при нескольких минутах воздействия атмосферного кислорода. Именно для них разработаны наиболее сложные техники, описанные в этой статье.

Рассчитать для своей задачи

Анаэростаты и анаэробные пакеты (простые методы)

Наиболее доступный способ создания анаэробных условий - герметичные контейнеры с химическими генераторами бескислородной атмосферы.

Анаэростат (анаэробный контейнер) - ёмкость из нержавеющей стали или поликарбоната с плотно закрывающейся крышкой. В ней размещают засеянные чашки Петри, затем помещают газогенерирующий пакет. Наиболее распространённые пакеты типа AnaeroGen (Oxoid) содержат аскорбиновую кислоту и бикарбонат натрия: при контакте с влажным воздухом выделяется $\text{CO}_2$, а оставшийся кислород поглощается катализатором (палладиевые гранулы). Итоговая атмосфера: $\text{O}_2$ < 1%, $\text{CO}_2$ 5-9%. Индикаторные полоски с резазурином (синий в присутствии $\text{O}_2$, бесцветный при его отсутствии) подтверждают успешное создание анаэробной среды.

Ограничение метода: пакеты не создают атмосферу $\text{H}_2 + \text{CO}_2$ и не подходят для строгих анаэробов с требованием ниже 0,5% $\text{O}_2$. Для факультативных анаэробов и умеренных анаэробов - быстро, дёшево, надёжно.

Аналогичный принцип лежит в основе свечного эксикатора: сжигающаяся свеча потребляет кислород, создавая атмосферу с $\text{CO}_2$ 2-3% и сниженным содержанием $\text{O}_2$ (до 17%). Метод грубый, но исторически важный и подходит для капнофилов типа Neisseria gonorrhoeae.

Анаэробная камера (перчаточный бокс)

Для работы со строгими анаэробами золотым стандартом считается анаэробная камера (glove box, anaerobic workstation). Это герметичный бокс из прозрачного пластика с встроенными перчатками для манипуляций внутри без нарушения атмосферы.

Внутренняя атмосфера: смесь $\text{N}_2 + \text{H}_2 + \text{CO}_2$ (обычно 85:10:5). Водород необходим для каталитического удаления следов кислорода при помощи палладиевого катализатора:

$2\text{H}_2 + \text{O}_2 \xrightarrow{\text{Pd}} 2\text{H}_2\text{O}$

Шлюзовая камера позволяет вносить расходники (среды, чашки, инструменты) без нарушения основной атмосферы: предмет помещают в шлюз, откачивают воздух, заполняют $\text{N}_2$, затем открывают внутреннюю дверцу. Стандартный цикл шлюзования - 3-4 минуты. Датчики кислорода с точностью до 1 ppm контролируют атмосферу в режиме реального времени.

Ключевые правила работы в перчаточном боксе:

• Все материалы должны быть предварительно дегазированы перед внесением в шлюз (оставить в открытом шлюзе под продувкой $\text{N}_2$ минимум 20 минут).
• Агаровые среды вносятся расплавленными (при 50-55 °C) или предварительно восстановленными минимум 24 часа в атмосфере камеры.
• Тонкие резиновые перчатки боксов быстро проницаемы для кислорода - менять при первых признаках трещин.

Рассчитать для своей задачи

Техника Хангейта (Roll-tube)

Метод Хангейта (1950) произвёл революцию в экологической микробиологии анаэробов: впервые стало возможным работать со строжайшими анаэробами без громоздкого перчаточного бокса. Принцип - работа в системе закрытых пробирок с непрерывной продувкой газом прямо во время манипуляций.

Оборудование: стеклянные серологические пробирки 18×150 мм с ватно-резиновой или резиновой пробкой; трубки Хангейта; игла-канюля для подачи газа $\text{CO}_2$ или $\text{N}_2/\text{CO}_2$.

Протокол приготовления сред:

1. Питательный бульон готовят с редуцирующими агентами (цистеин-HCl 0,025%, сульфид натрия 0,025%), кипятят для удаления растворённого $\text{O}_2$.
2. В горячем виде разливают в пробирки в токе $\text{CO}_2$, немедленно укупоривают.
3. Стерилизуют автоклавированием при 121 °C 15 минут.

Roll-tube (чашки в пробирке): к бульону добавляют агар (1,5-2%). Расплавленную среду разливают в пробирки, укупоривают и немедленно вращают на льду - агар застывает тонким слоем по всей внутренней поверхности пробирки, образуя «свёрнутую чашку». Посев выполняют инъекцией культуры иглой через пробку в токе газа; колонии после инкубации видны через стекло без вскрытия.

Питательные среды для анаэробов

Состав среды для анаэробов решает сразу несколько задач: обеспечить питание, снизить окислительно-восстановительный потенциал (Eh) и поддерживать его на уровне, необходимом конкретной группе.

Редуцирующие агенты - обязательные компоненты сред для строгих анаэробов:

• Цистеин-HCl (0,02-0,05%) - аминокислота с тиольной группой; наиболее мягкий и физиологичный редуктант. Снижает Eh до -150...-200 мВ.
• Сульфид натрия (0,02-0,05%) - более сильный редуктант (Eh до -300...-400 мВ), необходим для метаногенов и СРБ.
• Тиогликолат натрия - используется в полужидких тиогликолатных средах как универсальный редуктант и показатель глубины анаэробиоза.
• Дитиотреитол (ДТТ) и аскорбиновая кислота - дополнительные агенты.

Индикатор анаэробности: резазурин в концентрации 0,0001% добавляют прямо в среду. В окисленной среде он розовый (резоруфин при частичном восстановлении) или синий (при полном окислении). В восстановленной среде, пригодной для строгих анаэробов, - бесцветный. Если перед посевом среда розовая - выбросить и приготовить заново.

Стандартные базовые среды:

• PYG (Peptone-Yeast-Glucose) - универсальная основа для широкого спектра анаэробов;
• среда Постгейта B и C - для сульфатредуцирующих бактерий, содержит $\text{FeSO}_4$, лактат, сульфат;
• среда DSM 119 (CO$_2$/H$_2$-бульон) - для метаногенов.

Контроль атмосферы и газовые смеси

Атмосфера анаэробного культивирования подбирается под физиологические потребности конкретной группы.

Классические смеси:

• $\text{N}_2 / \text{CO}_2$ (80:20) - базовая для большинства анаэробов кишечника (Bacteroides, Prevotella), клостридий;
• $\text{H}_2 / \text{CO}_2$ (80:20) - для гидрогенотрофных метаногенов (Methanobacterium, Methanobrevibacter), использующих $\text{CO}_2 + 4\text{H}_2 \rightarrow \text{CH}_4 + 2\text{H}_2\text{O}$;
• $\text{N}_2 / \text{H}_2 / \text{CO}_2$ (85:10:5) - универсальная смесь для перчаточных боксов;
• чистый $\text{N}_2$ - для организмов без потребности в $\text{CO}_2$.

CO$_2$-потребность: большинство анаэробов стимулируются $\text{CO}_2$ (5-10%) - он необходим для карбоксилирования и поддержания буферной ёмкости среды (бикарбонатный буфер). Среды для анаэробов поэтому часто имеют pH 6,5-7,5 с добавлением $\text{NaHCO}_3$.

Стоит учитывать, что аналогичные принципы управления атмосферой используются при изучении анаэробного дыхания бактерий различных типов.

Методы посева и выделения чистых культур

Стандартные методы посева (шпатель, петля на открытой чашке) неприменимы для строгих анаэробов. Альтернативы:

Предварительно восстановленные чашки: готовые анаэробные агаровые чашки инкубируют в анаэробной камере 48 часов до посева, чтобы восстановить следы растворённого $\text{O}_2$. Посев выполняют только внутри камеры.

Roll-tube (см. §4): посев через пробку иглой, всё внутри запаянной пробирки.

Инъекционный метод: культуру набирают в шприц с тупой иглой (blunt needle), среду в герметичной пробирке - в обоих случаях воздух замещён $\text{N}_2$. Инъекция через резиновую пробку. Метод требует минимум оборудования, но требователен к технике.

Серийные разведения в анаэробных условиях: пробирки с 10-кратными разведениями готовят при непрерывной подаче газа; для плотных сред - Roll-tube разведения.

Субкультивирование строгих анаэробов из колоний в Roll-tube - навык: каждую колонию вырезают иглой прямо через стекло (или специальным зондом через пробку), не нарушая атмосферу пробирки.

Рассчитать для своей задачи

Частые ошибки

• Не восстанавливать среду перед посевом. Даже автоклавированная среда может содержать растворённый $\text{O}_2$ (до 8 мг/л), если её не кипятили и не продували газом. Розовый цвет резазурина - сигнал опасности.
• Слишком долго держать открытой пробирку. В методе Хангейта каждая дополнительная секунда без потока газа создаёт риск. Операции должны быть отработаны и выполняться уверенно.
• Смешивать анаэробов с разными требованиями к атмосфере. Умеренный анаэроб B. fragilis и строгий метаноген имеют разные окна Eh. Единый режим не подходит для обоих.
• Игнорировать температуру агара при разливке. Если агар остыл ниже 45 °C - он застынет в трубке или колбе, не успев поступить в пробирку. Выше 55 °C - убьёт посевной материал.
• Не проверять герметичность анаэростата. Треснутая прокладка или недотянутые зажимы приведут к подсосу воздуха; индикаторная полоска не изменит цвет, но кислород всё равно проникнет.

FAQ

Как долго можно хранить предварительно восстановленные среды? Закупоренные герметично пробирки с восстановленными средами хранятся при 4 °C до 3 месяцев, если резазурин бесцветный. При порозовении среду следует выбросить: она окислилась.

Нужна ли анаэробная камера для работы с Clostridium difficile? C. difficile - умеренный анаэроб; допускает кратковременный контакт с кислородом. Для рутинного культивирования достаточно анаэростата с пакетом AnaeroGen. Однако для первичного посева клинического материала и выделения чистой культуры камера повышает результативность.

Можно ли культивировать анаэробы без специального газового оборудования? Для факультативных анаэробов и аэротолерантных - да, через аскорбатные пакеты или свечной эксикатор. Для строгих облигатных анаэробов отказ от правильной атмосферы означает провал культивирования - никакое редуцирующее вещество в среде не компенсирует атмосферный кислород.

Коротко

Методы культивирования анаэробных бактерий подбираются под степень кислородной чувствительности организма: анаэростаты с газогенерирующими пакетами подходят для факультативных и умеренных анаэробов; анаэробная камера с атмосферой $\text{N}_2/\text{H}_2/\text{CO}_2$ и палладиевым катализатором - стандарт для строгих анаэробов; техника Хангейта (Roll-tube) позволяет работать с метаногенами и сульфатредукторами без дорогого бокса. Во всех случаях обязательны: предварительное восстановление сред редуцирующими агентами, контроль атмосферы индикатором резазурином и строжайшее соблюдение протокола обращения с газом.