Окраска по Цилю-Нильсену: кислотоустойчивые бактерии

Кислотоустойчивость - это свойство клеточной стенки ряда бактерий удерживать карболфуксин даже после обработки смесью кислоты и спирта. Оно объединяет разнородную группу микроорганизмов: прежде всего микобактерии, а также ноккардии, ооцисты криптоспоридий и некоторых других возбудителей. Метод Циля-Нильсена выявляет именно это свойство - и от того, кто в данном конкретном случае его проявляет, напрямую зависит тактика лечения и эпидемиологические меры.

Молекулярная основа кислотоустойчивости

Феномен кислотоустойчивости обусловлен высоким содержанием миколовых кислот в клеточной стенке. Это разветвлённые жирные кислоты с длиной углеродной цепи до 90 атомов. Они ковалентно связаны с арабиногалактаном, который, в свою очередь, прикреплён к пептидогликану. Снаружи миколовые кислоты образуют плотный гидрофобный барьер - непроницаемый при комнатной температуре, но открывающийся при нагревании.

Именно поэтому горячий метод Циля-Нильсена и работает: нагрев расширяет промежутки в восковом слое, молекулы карболфуксина проникают внутрь и связываются гидрофобными взаимодействиями с ацильными хвостами миколовых кислот. После остывания барьер восстанавливается и надёжно удерживает краситель. Деколоризатор (смесь кислоты со спиртом) вымывает фуксин из некислотоустойчивых клеток, но не в силах преодолеть восковую оболочку.

Степень кислотоустойчивости у разных видов варьирует. Mycobacterium tuberculosis - классически и стойко кислотоустойчива. Ноккардии - лишь частично (только при 1% кислоте, но не при 3%). Ооцисты криптоспоридий - слабокислотоустойчивы (используется модифицированный ZN). Это различие помогает в дифференциальной диагностике.

Рассчитать для своей задачи

Mycobacterium tuberculosis: главная мишень ZN

Комплекс Mycobacterium tuberculosis (КМТБ) - главный повод для ZN-исследования в клинической практике. Он включает несколько близкородственных видов: M. tuberculosis (собственно возбудитель туберкулёза человека), M. bovis (туберкулёз крупного рогатого скота, зоонозная угроза), M. africanum (Западная Африка) и несколько других видов.

При ZN-окраске мокроты M. tuberculosis выглядит как тонкие, слегка изогнутые ярко-красные палочки длиной 1-4 мкм. Характерно зернистое или «чёточное» расположение красителя внутри клетки (артефакт неравномерного распределения липидных включений). Клетки нередко лежат группами, что описывается как «стайки рыб» или «россыпь».

Количественная оценка по шкале ВОЗ имеет прямое клиническое значение: степень +3 (более 10 палочек в поле зрения) соответствует высокой бактериальной нагрузке и максимальной эпидемиологической опасности. Порог обнаружения метода - около 5000-10 000 бактерий на 1 мл мокроты, что значительно выше, чем у культуры и ПЦР.

Mycobacterium leprae и диагностика лепры

Mycobacterium leprae - возбудитель лепры (проказы) - представляет особый случай. Этот вид не поддаётся культивированию на искусственных питательных средах до сих пор (после 150 лет попыток). Единственная возможность вырастить его в лаборатории - инокуляция подушечек лап девятипоясного броненосца.

В такой ситуации ZN-бактериоскопия становится незаменимым методом диагностики. Материал - биоптат кожи или мочки уха (соскоб). В препарате видны крупные скопления красных палочек, нередко образующих характерные «пачки сигарет» (globi) - скопления внутри клеток макрофагов (лепромных клеток, или клеток Вирхова).

Бактериальный индекс при лепроматозной форме лепры достигает 6+ (миллионы бактерий на 1 мл), что делает ZN-картину очень наглядной. При туберкулоидной форме лепры бактерии в препаратах практически не обнаруживаются - диагноз ставится клинически и гистологически. Важно, что метод окраски по Граму для микобактерий непригоден: их восковая оболочка не взаимодействует со стандартными красителями Грама.

Нетуберкулёзные микобактерии (NTM)

Нетуберкулёзные микобактерии (Non-tuberculous mycobacteria, NTM) - большая группа из более чем 170 видов, которые в отличие от M. tuberculosis не передаются от человека к человеку, а выделяются из окружающей среды (вода, почва, биоплёнки в водопроводе). При ZN-окраске они неотличимы от туберкулёзных палочек по морфологии - красные кислотоустойчивые палочки.

Клиническое значение NTM резко возросло с распространением ВИЧ-инфекции. Mycobacterium avium complex (MAC) - наиболее частый NTM-патоген у иммунокомпрометированных пациентов - вызывает диссеминированный микобактериоз при CD4 < 50 клеток/мкл. M. kansasii поражает лёгкие и рентгенологически неотличим от ТБ. M. fortuitum, M. chelonae, M. abscessus - быстрорастущие NTM, вызывающие раневые инфекции, инфекции после операций и нозокомиальные вспышки.

Различить виды NTM между собой и отделить их от КМТБ по ZN невозможно. Для этого нужны культуральные методы, биохимические тесты или молекулярная идентификация (секвенирование гена 16S рРНК, MALDI-TOF). Именно поэтому положительный ZN-результат требует обязательного посева.

Рассчитать для своей задачи

Nocardia: частичная кислотоустойчивость

Ноккардии занимают особое место среди «почти кислотоустойчивых» микроорганизмов. Это грамположительные бактерии из типа Actinobacteria - того же, что и микобактерии. Они содержат миколовые кислоты, но значительно более короткие (до 60 атомов углерода против 90 у M. tuberculosis).

Следствие - частичная кислотоустойчивость: ноккардии удерживают карболфуксин при обработке 1% кислотой, но обесцвечиваются при стандартных 3-5%. Поэтому при стандартном ZN-протоколе ноккардии окрашиваются непредсказуемо: иногда частично красные, иногда полностью обесцвеченные. Для их выявления используется модифицированный ZN с 1% серной кислотой.

Клинически Nocardia asteroides complex вызывает нокардиоз - нередко у иммунокомпрометированных пациентов: лёгочная форма, абсцессы мозга, диссеминированная инфекция. Морфологически в препарате ноккардии выглядят как тонкие ветвящиеся нити или фрагментированные палочки - это важный дифференциальный признак от коротких прямых палочек микобактерий.

Криптоспоридии: ZN для паразитологии

Метод Циля-Нильсена используется и за пределами бактериологии. Cryptosporidium parvum и C. hominis - протозойные паразиты, ооцисты которых слабокислотоустойчивы. В модифицированном ZN (1% кислота, без нагрева или слабый нагрев) ооцисты окрашиваются в розово-красный цвет на голубом фоне и видны как маленькие сферические структуры диаметром 4-6 мкм.

Это особенно ценно при диагностике диареи у ВИЧ-инфицированных, а также у детей в учреждениях. Традиционные методы копрологии ооцисты криптоспоридий пропускают; ZN (или флуоресцентная микроскопия с аурамин-родамином) - специфический метод.

Сравнение с аурамин-родаминовой флуоресценцией

Параллельно с классическим ZN существует флуоресцентная модификация - окраска аурамин-родамином. Механизм тот же: флуорохромы связываются с миколовыми кислотами. Преимущества: просматривается при меньшем увеличении (×250 против ×1000 для ZN), один лаборант успевает просмотреть в 2-3 раза больше полей за то же время.

Чувствительность аурамин-родаминового метода несколько выше (55-80% против 45-70% для ZN). Недостатки: дорогой флуоресцентный микроскоп, аурамин - потенциальный канцероген. ВОЗ рекомендует использовать флуоресцентную микроскопию как скрининговый метод с подтверждением положительных случаев классическим ZN - именно так устроены референс-лаборатории в ресурсных странах.

Для стандартных условий средств сравнение не в пользу флуоресценции - методы стерилизации в микробиологии и базовое оборудование для ZN доступны в любой лаборатории второго уровня биобезопасности.

Рассчитать для своей задачи

Частые ошибки

• Считать положительный ZN диагнозом туберкулёза. Положительный ZN означает только кислотоустойчивость. Это могут быть NTM, ноккардии, контаминация. Посев и молекулярные методы обязательны для видовой идентификации.
• Игнорировать степень бактериальной нагрузки. Сомнительный результат (1-9 палочек на 100 полей) не равнозначен отрицательному: требуется повтор на втором образце, а не выдача «отрицательно».
• Применять стандартный ZN для выявления ноккардий. При 3% кислоте ноккардии обесцвечиваются. Для них нужна модификация с 1% серной кислотой или параллельная окраска по Граму (где они грамположительны и видны как ветвящиеся нити).
• Путать NTM и M. tuberculosis при ВИЧ-инфекции. У иммунокомпрометированных пациентов положительный ZN из мокроты нередко обусловлен NTM, не передающимися воздушно-капельным путём. Изоляция больного по типу ТБ в таком случае избыточна, а лечение принципиально иное.
• Брать только один образец при отрицательном ZN. Чувствительность первого мазка - 45-70%. Три последовательных образца утренней мокроты принципиально улучшают выявляемость.

FAQ

Можно ли по ZN отличить M. tuberculosis от нетуберкулёзных микобактерий? Нет. Все кислотоустойчивые микобактерии дают в ZN одинаково красные палочки. Их различают по скорости роста на культуре, биохимическим тестам (ниациновый тест, каталазная активность, нитратредукция) и молекулярно-генетическим методам (ПЦР, секвенирование 16S рРНК, MALDI-TOF).

Почему ZN не работает с грамом для микобактерий? Микобактерии из-за высокого содержания миколовых кислот практически не воспринимают красители Грама - нативный кристаллический фиолетовый плохо проникает через восковую стенку, и клетки либо окрашиваются слабо грамположительно, либо вовсе не окрашиваются. Это свойство называют «грамнейтральностью». Именно поэтому ZN был разработан как специализированный метод для этой группы.

Как долго кислотоустойчивые бактерии сохраняют окраску в ZN-препарате? Фиксированные мазки, окрашенные по ZN, стабильны при правильном хранении (сухое, тёмное место, под покровным стеклом) месяцами и даже годами. Это позволяет использовать их как архивный материал для ретроспективного анализа и аудита лаборатории. Фотографирование под микроскопом перед передачей стекла в архив - стандарт контроля качества.

Коротко

Окраска по Цилю-Нильсену выявляет кислотоустойчивость - свойство клеточной стенки, богатой миколовыми кислотами, удерживать карболфуксин после обработки кислотой и спиртом. Основные мишени метода: комплекс M. tuberculosis (туберкулёз), M. leprae (лепра, незаменим ввиду некультивируемости), нетуберкулёзные микобактерии (особенно у иммунокомпрометированных). Частично кислотоустойчивы ноккардии (выявляются лишь при 1% кислоте) и ооцисты криптоспоридий (модифицированный ZN). Положительный ZN подтверждает кислотоустойчивость, но не вид: для диагноза необходимы посев и молекулярная идентификация.