Амфотерность аминокислот: заряд, pI и реакции

Аминокислоты - это уникальные соединения, которые несут одновременно кислотную группу (-COOH) и основную (-NH2). Именно поэтому они проявляют амфотерные свойства: могут реагировать и с кислотами, и со щелочами. Чтобы понять, какой заряд несёт аминокислота при данном pH и почему это важно для электрофореза и биохимии белков, подвигайте ползунок в калькуляторе ниже - он мгновенно покажет распределение всех трёх форм.

Строение альфа-аминокислоты и источник амфотерности

Все природные аминокислоты имеют одну общую структуру: атом углерода (альфа-углерод) связан с аминогруппой $-\text{NH}_2$, карбоксильной группой $-\text{COOH}$, водородом и боковой цепью $R$. Такое строение и определяет двойственность химических свойств.

Карбоксильная группа - донор протона (кислота по Бренстеду):

$\text{NH}_2\text{-CHR-COOH} \;\rightleftharpoons\; \text{NH}_2\text{-CHR-COO}^- + H^+$

Аминогруппа - акцептор протона (основание по Бренстеду):

$\text{NH}_2\text{-CHR-COOH} + H^+ \;\rightleftharpoons\; {}^+\text{NH}_3\text{-CHR-COOH}$

Оба процесса происходят в воде, причём при физиологическом pH в молекуле одновременно действуют обе группы. Поэтому аминокислоты существуют не в нейтральной форме, а в виде внутренней соли - цвиттер-иона.

Рассчитать для своей задачи

Цвиттер-ион и три формы аминокислоты

В водном растворе аминокислота существует в виде равновесной смеси трёх форм в зависимости от pH:

• Катионная форма $\text{NH}_3^+\text{-CHR-COOH}$ - при сильнокислой среде (pH $\ll$ pKa$_1$): обе группы протонированы, молекула несёт положительный заряд.
• Цвиттер-ион ${}^+\text{NH}_3\text{-CHR-COO}^-$ - при промежуточном pH (pKa$_1 <$ pH $<$ pKa$_2$): карбоксил депротонирован, амин протонирован; суммарный заряд равен нулю.
• Анионная форма $\text{NH}_2\text{-CHR-COO}^-$ - при щелочной среде (pH $\gg$ pKa$_2$): обе группы депротонированы, молекула несёт отрицательный заряд.

Доля каждой формы описывается через уравнение Хендерсона-Хассельбаха. Для знаменателя $D = 1 + 10^{\text{pH}-pKa_1} + 10^{2\text{pH}-pKa_1-pKa_2}$:

$\alpha_{\text{cat}} = \frac{1}{D}, \quad \alpha_{\text{zwit}} = \frac{10^{\text{pH}-pKa_1}}{D}, \quad \alpha_{\text{an}} = \frac{10^{2\text{pH}-pKa_1-pKa_2}}{D}$

Именно эти кривые строит калькулятор выше: при смещении ползунка видно, как одна форма сменяет другую с нарастанием pH.

Рассчитать для своей задачи

Изоэлектрическая точка pI

Изоэлектрическая точка (pI) - это значение pH, при котором средний заряд молекулы аминокислоты равен нулю. При pH = pI концентрации катионной и анионной форм совпадают (цвиттер-ион преобладает), и молекула не движется в электрическом поле.

Для простых (нейтральных) альфа-аминокислот формула расчёта pI:

$pI = \frac{pKa_1 + pKa_2}{2}$

Для глицина $pKa_1 = 2{,}35$, $pKa_2 = 9{,}60$, поэтому:

$pI(\text{Гли}) = \frac{2{,}35 + 9{,}60}{2} = 5{,}97$

Для кислых аминокислот (аспарагиновая кислота, глутаминовая) pI смещается в кислую сторону: третья ионогенная группа - вторая COOH - добавляет ещё одно pKa, и pI рассчитывается как среднее двух карбоксильных pKa:

$pI(\text{Асп}) = \frac{pKa_1 + pKa_3(\text{COOH бок.})}{2} = \frac{1{,}88 + 3{,}65}{2} = 2{,}77$

Для основных аминокислот (лизин, аргинин, гистидин) pI сдвинуто в щелочную сторону:

$pI(\text{Лиз}) = \frac{pKa_2(\text{NH}_3^+) + pKa_3(\varepsilon\text{-NH}_3^+)}{2} = \frac{8{,}95 + 10{,}53}{2} = 9{,}74$

Значение pI используется при разделении смесей аминокислот электрофорезом: при pH буфера = pI одной кислоты она остаётся на старте, остальные двигаются к аноду или катоду.

Реакции с кислотой и со щёлочью

Амфотерность аминокислот подтверждается двумя типами химических реакций.

Реакция с сильной кислотой (например, HCl) - аминогруппа принимает протон:

$\underbrace{{}^+\text{NH}_3\text{-CH}_2\text{-COO}^-}_{\text{цвиттер-ион глицина}} + \text{HCl} \;\to\; {}^+\text{NH}_3\text{-CH}_2\text{-COOH} + \text{Cl}^-$

Продукт - хлоргидрат аминокислоты (соль катионной формы). Реакция аналогична нейтрализации основания.

Реакция со щёлочью (NaOH) - карбоксильная группа отдаёт протон:

${}^+\text{NH}_3\text{-CH}_2\text{-COO}^- + \text{NaOH} \;\to\; \text{NH}_2\text{-CH}_2\text{-COONa} + \text{H}_2\text{O}$

Продукт - натриевая соль аминокислоты (форма аниона). Реакция аналогична нейтрализации кислоты.

Обе реакции - пример кислотно-основного взаимодействия цвиттер-иона, подчёркивающего амфотерную природу аминокислот. Именно это свойство делает аминокислоты эффективными буферами в биологических системах.

Электрофорез и практическое использование pI

Знание pI позволяет предсказывать поведение аминокислот и белков в электрическом поле:

• Если pH раствора ниже pI аминокислоты, она несёт положительный заряд и движется к катоду (отрицательному электроду).
• Если pH раствора выше pI, молекула несёт отрицательный заряд и движется к аноду (положительному электроду).
• При pH = pI молекула нейтральна и остаётся на месте.

Пример: в буфере с pH = 7 смесь глицина (pI = 5,97) и лизина (pI = 9,74) разделяется - глицин несёт отрицательный заряд (pH > pI) и идёт к аноду, лизин несёт положительный (pH < pI) и идёт к катоду.

Буферные свойства и роль в биохимии

Амфотерность аминокислот имеет огромное практическое значение в живых системах. Аминокислоты и пептиды входят в состав буферных систем крови и тканей, поддерживая постоянство pH внутри клеток. Принцип действия такого буфера прост: при добавлении кислоты цвиттер-ион переходит в катионную форму (связывает протон), при добавлении щёлочи - в анионную (отдаёт протон). В обоих случаях pH изменяется незначительно.

Суммарный заряд белковой молекулы определяется набором всех заряженных боковых цепей аминокислотных остатков. При pH ниже pI белок в целом заряжен положительно; при pH выше pI - отрицательно. Это используется при очистке белков методом ионообменной хроматографии: белок с нужным pI элюируют при подходящем значении pH, тогда как примеси с другими pI остаются на смоле.

Знание pI конкретного белка необходимо при разработке условий осаждения: при pH = pI электростатическое отталкивание между молекулами минимально, поэтому белок агрегирует и выпадает в осадок. Именно так разработаны процессы получения казеина из молока (pI около 4,6) - снижением pH ацетатным буфером до изоэлектрической точки.

Интересно, что пептидные связи не несут заряда при физиологическом pH, поэтому заряд полипептида определяется исключительно N- и C-концами цепи плюс ионогенными боковыми цепями. Для расчёта pI белка используют итерационные методы: значение pH подбирается так, чтобы суммарный заряд всех остатков обращался в ноль. Онлайн-калькуляторы (например, ExPASy ProtParam) делают этот расчёт автоматически по последовательности.

Пример решения задачи

Задача. Аланин ($pKa_1 = 2{,}34$; $pKa_2 = 9{,}69$) растворён в буфере pH = 10,5. Определите преобладающую форму и напишите реакцию аланина со щёлочью.

Решение.

Шаг 1. Вычислим pI аланина:

$pI = \frac{2{,}34 + 9{,}69}{2} = 6{,}01$

Шаг 2. Сравниваем pH с pKa$_2$: pH = 10,5 > pKa$_2$ = 9,69. Значит, аминогруппа уже депротонирована ($-\text{NH}_2$), карбоксил тоже ($-\text{COO}^-$). Преобладает анионная форма $\text{NH}_2\text{-CH(CH}_3)\text{-COO}^-$.

Шаг 3. Реакция со щёлочью (из цвиттер-иона):

${}^+\text{NH}_3\text{-CH(CH}_3)\text{-COO}^- + \text{NaOH} \;\to\; \text{NH}_2\text{-CH(CH}_3)\text{-COONa} + \text{H}_2\text{O}$

Шаг 4. Заряд при pH = 10,5. Поскольку pH > pI = 6,01, аланин несёт отрицательный заряд и в электрофорезе движется к аноду.

Частые ошибки

• Путаница цвиттер-иона с нейтральной молекулой. Цвиттер-ион ${}^+\text{NH}_3\text{-CHR-COO}^-$ несёт два противоположных заряда, но суммарно нейтрален. Это не то же самое, что незаряженная форма $\text{NH}_2\text{-CHR-COOH}$: последняя практически не существует при физиологическом pH.
• Неверное применение формулы pI для кислых/основных аминокислот. Формула $pI = (pKa_1 + pKa_2)/2$ работает только для нейтральных аминокислот с двумя ионогенными группами. Для кислых - использовать два наименьших pKa, для основных - два наибольших.
• Неправильный знак заряда в реакции. При реакции с HCl аминокислота приобретает положительный заряд; при реакции с NaOH - отрицательный. Не путайте направление.
• Игнорирование температуры. pKa и pI зависят от температуры. Стандартные значения приведены для 25 °C; при 37 °C (температуре тела) pKa немного отличаются.
• Ошибки в написании формул. Цвиттер-ион пишется с ${}^+\text{NH}_3$, а не $\text{NH}_2$ - аминогруппа именно протонирована.

FAQ

Почему аминокислоты называют амфотерными соединениями? Потому что они содержат одновременно кислотную группу (-COOH, донор протона) и основную группу (-NH2, акцептор протона), что позволяет им реагировать и с кислотами, и со щелочами. Этим они отличаются от обычных кислот и оснований.

Как рассчитать pI для аминокислоты с тремя ионогенными группами? Для кислых аминокислот (аспарагиновая, глутаминовая кислоты) pI = (pKa$_1$ + pKa боковой COOH) / 2. Для основных (лизин, аргинин) pI = (pKa основного NH$_3^+$ + pKa боковой группы) / 2. В общем случае pI - среднее двух pKa, между которыми находится нейтральная форма.

Что произойдёт с глицином при pH = pKa1 = 2,35? При pH = pKa$_1$ доли катионной и цвиттер-ионной форм равны по 50%. Анионная форма практически отсутствует. Средний заряд молекулы равен +0,5 - молекула в среднем несёт половину положительного заряда.

Коротко

Амфотерность аминокислот обусловлена наличием карбоксильной (кислотной) и аминогрупп (основной) в одной молекуле. В водном растворе аминокислоты существуют в трёх формах - катионной, цвиттер-ионной и анионной - в зависимости от pH. Изоэлектрическая точка $pI = (pKa_1 + pKa_2)/2$ - pH нулевого заряда, при котором молекула не движется в электрофорезе. Реакция с HCl даёт катионную соль, реакция с NaOH - анионную. Эти свойства лежат в основе разделения аминокислот и белков методом электрофореза.