Фрагменты Оказаки: роль лигазы в репликации ДНК

Репликация ДНК у всех известных организмов идёт в одном направлении - от 5' к 3'-концу новой цепи. Для лидирующей цепи это не проблема: полимераза движется вперёд непрерывно, следуя за репликационной вилкой. Но матричная цепь для запаздывающей цепи ориентирована «против шерсти»: полимераза вынуждена синтезировать не одну длинную молекулу, а серию коротких кусков - фрагментов Оказаки, которые потом сшиваются в единую цепь. Именно здесь в дело вступает ДНК-лигаза. Ниже разберём весь механизм: от синтеза первого нуклеотида до последнего ник-лигирования. Чтобы сразу почувствовать числа, пройдитесь по калькулятору ниже - он считает число фрагментов и актов лигирования для любых параметров.

Почему запаздывающая цепь не может расти непрерывно

ДНК-полимераза не умеет начинать синтез с нуля - ей нужна свободная 3'-OH-группа праймера, к которой она присоединяет следующий нуклеотид. Обе цепи двойной спирали антипараллельны: одна матрица направлена 3'→5', другая 5'→3'. Лидирующая цепь синтезируется на 3'→5'-матрице и следует за вилкой без остановок. При этом ДНК-полимераза проявляет высокую процессивность - однажды связавшись с ДНК, она проходит тысячи нуклеотидов, не отрываясь от матрицы благодаря скользящему зажиму (sliding clamp).

Матрица запаздывающей цепи ориентирована 5'→3'. Это означает: по мере раскрытия вилки новый участок одноцепочечной матрицы «открывается» не впереди по ходу движения полимеразы, а позади неё. Полимераза не может просто развернуться и пойти назад. Вместо этого каждый раз, когда освобождается очередной участок матрицы длиной $L$ нуклеотидов, примаза синтезирует новый РНК-праймер, от которого начинается следующий фрагмент Оказаки. Петлевая модель репликосомы (trombone model) объясняет, как обе полимеразы работают в одной и той же репликосоме: запаздывающая цепь образует петлю, чтобы полимераза двигалась в том же направлении, что и вилка.

Рассчитать для своей задачи

Стадии синтеза одного фрагмента Оказаки

Рассмотрим жизнь одного фрагмента Оказаки от начала до конца. Все четыре стадии идут последовательно, и результат каждой - входные данные для следующей.

1. Синтез РНК-праймера примазой. Примаза (РНК-полимераза с ослабленными требованиями к точности) синтезирует короткий РНК-фрагмент длиной 10-12 нуклеотидов у прокариот и около 10 нуклеотидов у эукариот. Именно он даёт свободный 3'-OH, с которого дальше работает ДНК-полимераза.

2. Элонгация ДНК-полимеразой III (у прокариот) или Pol $\delta$ (у эукариот). Полимераза присоединяется к 3'-OH праймера и наращивает дочернюю ДНК в направлении 5'→3' до тех пор, пока не достигнет 5'-конца предыдущего фрагмента. Длина синтезированного участка: у E. coli от 1000 до 2000 п.о., у млекопитающих 100-200 п.о.

3. Удаление праймера и заполнение бреши ДНК-полимеразой I. У прокариот ДНК Pol I обладает 5'→3'-экзонуклеазной активностью: она «сгрызает» РНК-праймер и одновременно заполняет образовавшуюся брешь ДНК. У эукариот за это отвечает другой набор ферментов (РНКаза H1 и Pol $\delta$).

4. Ник-лигирование ДНК-лигазой. После удаления праймера и заполнения бреши между двумя соседними фрагментами ДНК остаётся «ник» - разрыв фосфодиэфирной связи между 3'-OH одного фрагмента и 5'-фосфатом другого. ДНК-лигаза сшивает этот разрыв, используя НАД$^+$ (у прокариот) или АТФ (у эукариот) в качестве источника энергии.

Формулы: число фрагментов и время репликации

Чтобы решать задачи, нужно знать три ключевых соотношения.

Число фрагментов Оказаки на сегменте длиной $G$ при длине фрагмента $L$:

$N = \left\lceil \frac{G}{L} \right\rceil$

Время синтеза одного фрагмента при скорости вилки $v$:

$t_f = \frac{L}{v}$

Суммарное время репликации участка:

$t = \frac{G}{v}$

Обратите внимание: суммарное время $t = G/v$ не зависит от $L$ - будь фрагмент длиной 200 или 2000 п.о., весь участок G нуклеотидов синтезируется за одно и то же время. Число актов лигирования равно числу фрагментов $N$, поскольку каждый фрагмент даёт один ник.

Рассчитать для своей задачи

На схеме выше видны типичные размеры: у эукариот праймер занимает около 5% длины фрагмента, остальное - ДНК, синтезированная Pol $\delta$. Именно поэтому удаление праймера требует отдельной системы ферментов: оставить РНК в конечной молекуле ДНК нельзя - РНК менее стабильна химически и не несёт записи в тех позициях, где стояли праймеры.

Из формулы $N = \lceil G / L \rceil$ видно практическое следствие: если у E. coli длина фрагмента 1500 п.о., то на участке геномной ДНК 4,6 млн п.о. образуется порядка 3000 фрагментов с каждой стороны от единственного ori. При двунаправленной репликации (две вилки из одного ori) полное число фрагментов удвоится - около 6000 актов лигирования за одну репликацию.

ДНК-лигаза: механизм реакции

Лигаза соединяет два конца ДНК, образуя фосфодиэфирную связь из уже имеющихся 3'-OH и 5'-фосфата. Реакция идёт в три химических шага.

Шаг 1. Аденилирование лигазы. Лигаза реагирует с АТФ (эукариоты) или НАД$^+$ (прокариоты): аденилиловая группа ковалентно связывается с остатком лизина активного центра фермента.

Шаг 2. Перенос AMP на 5'-фосфат ника. Лигаза присоединяет AMP к 5'-фосфату разрыва, активируя его.

Шаг 3. Атака 3'-OH и выход AMP. Соседняя 3'-OH-группа атакует активированный фосфат, формируется фосфодиэфирная связь, и AMP уходит. Ник закрыт.

Энергетический итог: одна молекула АТФ (или НАД$^+$) расходуется на каждый ник. Из этого следует прямая связь с числом фрагментов Оказаки: за одну репликацию лидирующая цепь требует ровно одного ник-лигирования (стыковка с теломерой у эукариот), а запаздывающая - $N$ лигирований.

Различия у прокариот и эукариот

Принцип одинаков у всех организмов, но белки и числа заметно различаются.

У эукариот фрагменты в 5-10 раз короче, зато репликация идёт одновременно из тысяч точек начала (origins of replication). Каждый replicon охватывает от 50 до 300 тысяч п.о., и они реплицируются параллельно - именно это позволяет клетке человека с геномом 3 млрд п.о. уложиться в 6-8 часов S-фазы несмотря на скорость вилки, в 10-40 раз меньшую, чем у E. coli.

Важен ещё один белок запаздывающей цепи у эукариот - PCNA (proliferating cell nuclear antigen). Это тример, образующий кольцевой скользящий зажим вокруг ДНК. PCNA удерживает Pol $\delta$ на матрице и координирует смену полимераз при достижении праймера следующего фрагмента. Без PCNA Pol $\delta$ немедленно отрывается от ДНК при первом же препятствии.

Рассчитать для своей задачи

Частые ошибки

• Путаница с направлением синтеза. Синтез всегда идёт 5'→3'. Запаздывающая цепь синтезируется «обратно» по матрице - то есть в том же химическом направлении, но в противоположном направлении движения вилки.
• Смешение праймазы и ДНК-полимеразы. Примаза синтезирует только РНК-праймер и не продолжает синтез ДНК. ДНК-полимераза III берёт 3'-OH праймера и дальше добавляет дезоксирибонуклеотиды.
• Лигаза сшивает одноцепочечные разрывы, но не бреши. Лигаза закрывает именно ник (разрыв одной фосфодиэфирной связи), а не брешь (пропущенный участок). Брешь сначала заполняет Pol I или Pol $\delta$.
• Число лигирований равно числу фрагментов, но не числу репликационных вилок. Если геном реплицируется с двух вилок, число фрагментов удваивается - и число актов лигирования тоже.
• Кофактор лигазы у прокариот - НАД$^+$, не АТФ. Это важно в задачах, где спрашивают про энергетику реакции.

FAQ

Почему на лидирующей цепи фрагменты Оказаки не образуются? Лидирующая цепь синтезируется на 3'→5'-матрице. Полимераза движется в том же направлении, что и репликационная вилка, и добавляет нуклеотиды непрерывно. Ей нужен только один праймер - в самом начале. После его удаления Pol I (или аналог) заполняет единственную брешь, и одно лигирование закрывает её.

Какова судьба РНК-праймера? РНК-праймер удаляется после того, как следующий фрагмент Оказаки достигает его 5'-конца. У прокариот Pol I гидролизует РНК своей 5'→3'-экзонуклеазной активностью и тут же заполняет брешь ДНК. У эукариот РНКаза H1 расщепляет бо́льшую часть праймера, последний нуклеотид дополнительно обрабатывает Fen1, и брешь закрывает Pol $\delta$.

Можно ли посчитать число лигирований, зная только размер генома? Не напрямую. Нужно ещё знать длину фрагмента Оказаки и число репликационных вилок. Для диплоидной клетки E. coli (геном ~4,6 млн п.о., две вилки, L примерно 1500 п.о.) выйдет порядка 6000 фрагментов на один цикл репликации. Для клетки человека с тысячами origins цифра на несколько порядков больше, но и скорость вилки кратно ниже.

Коротко

Запаздывающая цепь синтезируется фрагментами Оказаки, потому что ДНК-полимераза не может работать в направлении 3'→5'. Каждый фрагмент начинается с РНК-праймера (примаза), дорастает до предыдущего фрагмента (Pol III / Pol $\delta$), затем праймер удаляется и брешь заполняется (Pol I / РНКаза H1). Остаётся ник - разрыв фосфодиэфирной связи, который запечатывает ДНК-лигаза, расходуя одну молекулу АТФ (у эукариот) или НАД$^+$ (у прокариот). Число лигирований равно числу фрагментов: $N = \lceil G / L \rceil$.