Метилирование ДНК: механизм эпигенетической регуляции

Геном человека содержит около 3 миллиардов пар нуклеотидов, но в каждой клетке активно лишь 10-15% генов - и это без изменения самой ДНК-последовательности. Механизм, управляющий этим избирательным включением генов, называется эпигенетической регуляцией. Метилирование ДНК - один из важнейших и наиболее изученных эпигенетических механизмов, определяющий, какие гены будут «прочитаны», а какие останутся молчать на протяжении жизни клетки и даже в следующих поколениях. Разобраться в этом механизме помогает инструмент ниже.

Что такое метилирование ДНК и где оно происходит

Метилирование ДНК - это ковалентное присоединение метильной группы ($-CH_3$) к азотистому основанию в составе ДНК. У млекопитающих этот процесс происходит почти исключительно в динуклеотидах CpG - парах «цитозин-фосфат-гуанин». Буква «p» здесь обозначает фосфодиэфирную связь, а не азотистое основание; следует не путать CpG-динуклеотид с парой нуклеотидов в комплементарных цепях.

Метильная группа присоединяется к атому углерода C5 цитозинового кольца, превращая цитозин в 5-метилцитозин ($^5mC$). Именно этот модифицированный нуклеотид расплавляет активность гена: метильная группа выступает в большую бороздку ДНК и физически препятствует связыванию транскрипционных факторов с промотором.

В геноме человека метилировано около 80% всех CpG-динуклеотидов. Большинство из них разбросаны по геному и метилированы в норме - прежде всего в повторяющихся элементах (транспозонах, сателлитной ДНК), которые таким образом «заглушаются» для поддержания геномной стабильности.

CpG-островки: метки активных промоторов

Несмотря на то что CpG в целом по геному редки и метилированы, существуют особые участки - CpG-островки - где эти динуклеотиды сгруппированы с плотностью, значительно превышающей среднюю. По определению, CpG-островок - это участок ДНК длиной не менее 200 п.н., в котором содержание GC-пар превышает 50%, а наблюдаемое соотношение CpG к ожидаемому - более 0,6.

Рассчитать для своей задачи

Около 70% промоторов генов млекопитающих содержат CpG-островки. Ключевое правило: когда CpG-островок в промоторе немелтилирован, ген обычно транскрипционно активен. Когда он метилирован - ген замолкает. Метилирование в промоторе выключает ген двумя путями:

1. Стерическое препятствие: метильная группа напрямую блокирует связывание факторов транскрипции с ДНК.
2. Рекрутмент репрессорных комплексов: специальные метил-связывающие белки (MeCP2, MBD1-4) распознают метилированные CpG и привлекают деацетилазы гистонов (HDAC), которые уплотняют хроматин в транскрипционно недоступную форму - гетерохроматин.

Таким образом, метилирование ДНК и модификации гистонов работают в тесной связке, формируя устойчивое эпигенетическое «замалчивание» генов.

Ферменты ДНК-метилтрансферазы: три игрока с разными ролями

Перенос метильной группы с SAM (S-аденозилметионина) на цитозин катализируют ферменты семейства DNMT (DNA methyltransferase). У млекопитающих их три основных представителя.

Рассчитать для своей задачи

DNMT1 - «поддерживающая» метилтрансфераза. Во время репликации ДНК вновь синтезированная цепь первоначально не метилирована - образуется полуметилированная (гемиметилированная) ДНК, в которой только материнская цепь несёт метки. DNMT1 распознаёт такие участки и немедленно метилирует дочернюю цепь по тем же CpG-позициям. Благодаря этому паттерн метилирования воспроизводится с каждым делением клетки - механизм эпигенетического наследования.

DNMT3a и DNMT3b - ферменты de novo метилирования. Они устанавливают новые метки метилирования на ранее немелтилированных сайтах - в частности, в период раннего эмбриогенеза, когда формируется тканеспецифический эпигеном. DNMT3a активна преимущественно в дифференцирующихся клетках, DNMT3b - в эмбриональных и пролиферирующих. Кофактор DNMT3L (каталитически неактивен сам по себе) стимулирует активность DNMT3a/3b, связывая немодифицированные хвосты гистона H3 (H3K4me0).

Механизм переноса метильной группы

На молекулярном уровне реакция метилирования протекает по следующему механизму:

1. DNMT связывается с ДНК и «выворачивает» целевой цитозин из двойной спирали (процесс base flipping) - это необходимо для доступа к C5-атому.
2. Остаток цистеина из каталитического центра фермента атакует C6 цитозина, образуя ковалентный промежуточный комплекс.
3. Метильная группа переносится с кофактора SAM (превращающегося в SAH - S-аденозилгомоцистеин) на C5 цитозина.
4. Промежуточный комплекс разрывается - продукт $^5mC$ освобождается.

Вся реакция требует участия SAM как донора метильной группы. При этом концентрация SAM в клетке зависит от доступности фолата и метионина - это один из путей, через которые питание влияет на эпигеном.

Деметилирование ДНК: пассивное и активное

Паттерн метилирования не является необратимым. Существуют два принципиально разных механизма деметилирования.

Пассивное деметилирование происходит при клеточных делениях в отсутствие DNMT1. Если фермент заблокирован или недоступен, дочерние цепи не метилируются и через несколько делений концентрация метильных меток снижается вдвое с каждым поколением клеток.

Активное деметилирование реализуется ферментами семейства TET (TET1, TET2, TET3). Они являются диоксигеназами и последовательно окисляют $^5mC$:

$^5mC \xrightarrow{\text{TET}} ^5hmC \xrightarrow{\text{TET}} ^5fC \xrightarrow{\text{TET}} ^5caC \xrightarrow{\text{TDG/BER}} C$

Конечные продукты - 5-формилцитозин ($^5fC$) и 5-карбоксилцитозин ($^5caC$) - удаляются ферментом тимин-ДНК-гликозилазой (TDG) и заменяются на немелтилированный цитозин в ходе репарации по механизму BER (base excision repair). Промежуточный продукт 5-гидроксиметилцитозин ($^5hmC$) имеет самостоятельные функции и обогащён в нейронах, где возможно служит отдельной эпигенетической меткой.

Геномный импринтинг и инактивация Х-хромосомы

Особенно наглядные примеры роли метилирования ДНК - геномный импринтинг и инактивация Х-хромосомы.

При геномном импринтинге гены импринтируются в половых клетках: в яйцеклетках метилируются одни аллели, в сперматозоидах - другие. В результате в соматических клетках зиготы только один из двух аллелей гена активен - в зависимости от того, от которого родителя он унаследован. Классические примеры: ген IGF2 активен только с отцовской хромосомы, ген H19 - только с материнской. Нарушения этого метилирования приводят к синдромам Прадера-Вилли, Ангельмана и синдрому Бекуита-Видемана.

Инактивация X-хромосомы у самок млекопитающих также поддерживается метилированием: промоторы генов на инактивированной Х-хромосоме метилируются, что обеспечивает стабильное молчание хромосомы в течение всей жизни клетки.

Эпигенетические нарушения при онкогенезе

В опухолевых клетках паттерн метилирования ДНК глубоко нарушен. Наблюдаются два противоположных явления, нередко сосуществующих в одной опухоли:

1. Глобальная гипометилирование: снижение уровня $^5mC$ по всему геному активирует транспозоны и протоонкогены, приводя к геномной нестабильности.

2. Локальная гиперметилирование промоторов генов-супрессоров опухолей: метилирование промоторов BRCA1, MLH1, CDKN2A (p16), VHL, RASSF1A «выключает» эти гены так же надёжно, как мутация - но без изменения последовательности. Такое эпимутационное замалчивание критических опухолевых супрессоров является ключевым событием в патогенезе многих типов рака.

Эти открытия привели к созданию эпигенетических препаратов - ингибиторов DNMT (азацитидин, децитабин), которые применяются при миелодиспластическом синдроме и остром миелоидном лейкозе. Схожие процессы описаны в связи с регуляцией апоптоза и клеточного цикла.

Частые ошибки

• Путают CpG-динуклеотид с парой CG: в записи «CpG» «p» - фосфат в одной цепи, а не пара в двойной спирали.
• Считают метилирование всегда репрессирующим: метилирование тела гена (gene body methylation) нередко коррелирует с высокой транскрипцией - репрессирует именно метилирование промоторных CpG-островков.
• Путают DNMT1 и DNMT3: DNMT1 - поддерживающая (работает на гемиметилированной ДНК при репликации), DNMT3a/3b - de novo (устанавливают новые метки).
• Не различают 5hmC и 5mC: гидроксиметилцитозин - это промежуточный продукт деметилирования, но и самостоятельная метка с особыми свойствами.
• Игнорируют роль питания: дефицит фолата и метионина снижает уровень SAM - донора метила - что непосредственно влияет на паттерн метилирования.

FAQ

Передаётся ли паттерн метилирования по наследству? В соматических клетках - да, через DNMT1 при каждом делении. Между поколениями организмов ситуация сложнее: в раннем эмбриогенезе паттерн метилирования в основном сбрасывается и восстанавливается заново. Однако примеры трансгенерационного эпигенетического наследования у млекопитающих задокументированы для некоторых локусов.

Можно ли изменить метилирование ДНК целенаправленно? Да. Инструменты на основе dCas9 (каталитически неактивная Cas9), слитого с DNMT3a или TET1, позволяют направленно метилировать или деметилировать конкретные геномные локусы без изменения последовательности ДНК. Это открывает перспективы для эпигеномного редактирования в терапии.

Зачем нужна гипометилирование транспозонов? Транспозоны - мобильные генетические элементы - составляют почти половину генома человека. Их метилирование в норме «замораживает» способность перемещаться по геному. При онкогенетической гипометилировании транспозоны активируются, создают двуцепочечные разрывы ДНК и способствуют хромосомным перестройкам, что ускоряет прогрессию опухоли.

Коротко

Метилирование ДНК - добавление $-CH_3$ к цитозину в CpG-динуклеотидах - это наследуемая эпигенетическая метка, контролирующая транскрипцию генов без изменения нуклеотидной последовательности. Ферменты DNMT1 воспроизводят паттерн при делениях, DNMT3a/3b устанавливают новые метки в эмбриогенезе, ферменты TET осуществляют активное деметилирование. Нарушения метилирования в промоторах генов-супрессоров опухолей и глобальное гипометилирование генома - ключевые эпигенетические события при онкогенезе, на которые направлено действие существующих эпигенетических препаратов.