Субстратное фосфорилирование в гликолизе: реакции и АТФ

Субстратное фосфорилирование в гликолизе - это способ получить АТФ напрямую, без участия дыхательной цепи и кислорода. Высокоэнергетический фосфат переносится с молекулы-субстрата прямо на АДФ. В гликолизе таких реакций ровно две, и студенты постоянно путают их ферменты и порядок. Ниже разберём оба шага по отдельности, посчитаем баланс и сравним этот механизм с окислительным фосфорилированием. Если нужно решить конкретную задачу по реакциям или энергетике гликолиза, соберите её в форме ниже.

Что такое субстратное фосфорилирование

Субстратное фосфорилирование - это синтез АТФ за счёт переноса фосфатной группы с высокоэнергетического промежуточного метаболита непосредственно на АДФ. Ключевое слово - непосредственно: фермент берёт фосфат у субстрата и сразу присоединяет его к АДФ в одной катализируемой реакции. Никакого трансмембранного градиента протонов и АТФ-синтазы здесь нет.

Чтобы реакция была возможной, у субстрата должен быть фосфат с очень высоким потенциалом переноса. Энергия гидролиза такой связи должна превышать энергию, нужную для образования концевой фосфоангидридной связи в АТФ. Стандартная энергия Гиббса гидролиза АТФ составляет около $\Delta G^{\circ\prime} = -30{,}5$ кДж/моль, поэтому донором может быть только соединение с ещё более отрицательным значением.

Рассчитать для своей задачи

В клетке работают два больших пути синтеза АТФ. Субстратное фосфорилирование идёт в цитозоле (гликолиз) и в матриксе митохондрий (цикл Кребса). Окислительное фосфорилирование происходит на внутренней мембране митохондрий и даёт основную массу АТФ. Гликолиз важен тем, что обеспечивает клетку энергией даже в анаэробных условиях, когда дыхательная цепь не работает.

Важно понимать терминологию. Сам термин фосфорилирование означает присоединение фосфатной группы; в данном случае акцептор - это АДФ, который превращается в АТФ. Слово субстратное подчёркивает, что донором служит именно молекула-субстрат метаболического пути, а не неорганический фосфат из раствора и не протонный градиент. Поэтому говорят о фосфорилировании на уровне субстрата: реакцию ведёт фермент-киназа, и весь акт переноса укладывается в одну элементарную стадию катализа.

Где в гликолизе возникает высокоэнергетический фосфат

Гликолиз делят на две фазы. В подготовительной (затратной) фазе клетка вкладывает две молекулы АТФ: на стадии гексокиназы и фосфофруктокиназы. Фосфаты здесь именно тратятся, поэтому к субстратному фосфорилированию эти шаги не относятся - в них АДФ не образуется из субстрата.

Окупаемость начинается во второй фазе, после расщепления фруктозо-1,6-бисфосфата на две триозы. Каждая триоза проходит одинаковую цепочку реакций, поэтому всё, что считается на одну триозу, удваивается на молекулу глюкозы. Именно во второй фазе появляются два соединения с фосфатом высокого потенциала переноса.

Первое такое соединение - 1,3-бисфосфоглицерат, ацилфосфат с $\Delta G^{\circ\prime}$ гидролиза около $-49{,}3$ кДж/моль. Второе - фосфоенолпируват (ФЕП), у которого потенциал переноса фосфата самый высокий среди метаболитов: $\Delta G^{\circ\prime} \approx -61{,}9$ кДж/моль. Оба значения по модулю больше, чем у АТФ, поэтому перенос фосфата на АДФ энергетически выгоден.

Первая реакция: фосфоглицераткиназа

Перед самой реакцией субстратного фосфорилирования идёт подготовительный шаг. Глицеральдегид-3-фосфат окисляется ферментом глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой. При этом восстанавливается $\text{NAD}^+$ до $\text{NADH}$, а к молекуле присоединяется неорганический фосфат - так и рождается высокоэнергетический ацилфосфат 1,3-бисфосфоглицерат:

$\text{Глицеральдегид-3-Ф} + \text{NAD}^+ + \text{Ф}_\text{н} \rightarrow \text{1,3-бисфосфоглицерат} + \text{NADH} + \text{H}^+$

Дальше включается фосфоглицераткиназа. Она переносит фосфат с первого углерода 1,3-бисфосфоглицерата на АДФ:

$\text{1,3-бисфосфоглицерат} + \text{АДФ} \rightarrow \text{3-фосфоглицерат} + \text{АТФ}$

Рассчитать для своей задачи

Это первая из двух реакций субстратного фосфорилирования. Обратите внимание: название фермента отражает обратную реакцию (фосфорилирование 3-фосфоглицерата), потому что в глюконеогенезе шаг идёт в противоположную сторону. Реакция близка к равновесию и легко обратима, что и позволяет использовать тот же фермент в биосинтезе глюкозы.

Вторая реакция: пируваткиназа

После фосфоглицераткиназы 3-фосфоглицерат превращается в 2-фосфоглицерат (фосфоглицератмутаза), а затем теряет воду под действием енолазы. Дегидратация перераспределяет энергию внутри молекулы и создаёт фосфоенолпируват - соединение с предельно высоким потенциалом переноса фосфата.

Финальный шаг катализирует пируваткиназа:

$\text{Фосфоенолпируват} + \text{АДФ} \rightarrow \text{Пируват} + \text{АТФ}$

Это вторая реакция субстратного фосфорилирования. В отличие от первой она практически необратима: большая разница энергий между ФЕП и АТФ делает $\Delta G$ сильно отрицательной. Образующийся сначала енолпируват самопроизвольно переходит в более устойчивый кетопируват, и именно эта таутомеризация делает реакцию однонаправленной. Поэтому в глюконеогенезе клетка не может пойти назад через пируваткиназу и использует обходной путь через оксалоацетат.

Связь с ферментативной кинетикой здесь прямая: скорость каждого шага задают $K_m$ и $V_{max}$ соответствующего фермента, а пируваткиназа дополнительно регулируется аллостерически. Подробнее о том, как константы описывают работу фермента, разобрано в материале про кинетику Михаэлиса-Ментен.

Энергетический баланс гликолиза

Сведём баланс на одну молекулу глюкозы. В затратной фазе уходят 2 АТФ. В фазе окупаемости каждая из двух триоз даёт по 2 АТФ субстратным фосфорилированием: 1 на фосфоглицераткиназе и 1 на пируваткиназе. Итого валовый выход - 4 АТФ.

$\text{Чистый выход} = 4\,\text{АТФ} - 2\,\text{АТФ} = 2\,\text{АТФ}$

Кроме того, образуются 2 молекулы $\text{NADH}$ (по одной на триозу) на стадии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. В аэробных условиях этот $\text{NADH}$ идёт в дыхательную цепь и даёт дополнительный АТФ уже через окислительное фосфорилирование. Но сам гликолиз чистыми приносит именно 2 АТФ, и все они получены субстратным фосфорилированием.

Эти 2 АТФ - причина, почему гликолиз работает в бескислородной среде: эритроциты без митохондрий, активная мышца, анаэробные микроорганизмы держатся именно на субстратном фосфорилировании гликолиза, а судьба пирувата (лактат или этанол) лишь регенерирует $\text{NAD}^+$ для продолжения процесса.

Чем субстратное фосфорилирование отличается от окислительного

Главное отличие - в источнике энергии. При субстратном фосфорилировании АТФ синтезируется за счёт химической энергии конкретной связи в молекуле-субстрате, реакцию ведёт растворимый фермент в одну стадию. При окислительном фосфорилировании энергия запасается в виде электрохимического градиента протонов на мембране, а АТФ-синтаза превращает энергию этого градиента в фосфоангидридную связь.

Отсюда вытекают практические различия. Субстратное фосфорилирование не требует кислорода и мембран, идёт быстро, но даёт мало АТФ. Окислительное фосфорилирование требует целой дыхательной цепи и кислорода как конечного акцептора электронов, зато даёт основной объём АТФ клетки. Гликолиз - резервный и быстрый источник, дыхание - основной и медленный. Аналогичное субстратное фосфорилирование встречается и в цикле Кребса на стадии сукцинил-КоА-синтетазы, где образуется ГТФ; этот цикл и его модификации разобраны в статье про глиоксилатный цикл.

Частые ошибки

• Считают подготовительную фазу источником АТФ. На стадиях гексокиназы и фосфофруктокиназы АТФ тратится, а не синтезируется.
• Путают ферменты местами. Сначала фосфоглицераткиназа (с 1,3-бисфосфоглицерата), потом пируваткиназа (с ФЕП), а не наоборот.
• Дают валовый выход вместо чистого. Гликолиз даёт 4 валовых АТФ, но чистыми только 2.
• Приписывают синтез АТФ дегидрогеназе. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа создаёт высокоэнергетический субстрат и $\text{NADH}$, но сам АТФ образует следующий фермент - киназа.
• Забывают про удвоение. Каждая реакция субстратного фосфорилирования срабатывает дважды на глюкозу, потому что триоз две.

FAQ

Сколько реакций субстратного фосфорилирования в гликолизе?

Две: реакция фосфоглицераткиназы (перенос фосфата с 1,3-бисфосфоглицерата на АДФ) и реакция пируваткиназы (перенос с фосфоенолпирувата на АДФ). На одну глюкозу каждая срабатывает дважды, давая в сумме 4 валовых АТФ.

Почему гликолиз называют анаэробным процессом?

Потому что субстратное фосфорилирование не требует кислорода: фосфат переносится прямо с субстрата на АДФ, без дыхательной цепи. Сам гликолиз идёт одинаково с кислородом и без него, кислород нужен лишь для последующего окисления $\text{NADH}$ и пирувата.

В чём разница между 1,3-бисфосфоглицератом и фосфоенолпируватом как донорами фосфата?

Оба - высокоэнергетические доноры, но ФЕП мощнее: его потенциал переноса фосфата выше, поэтому реакция пируваткиназы практически необратима, тогда как реакция фосфоглицераткиназы близка к равновесию и обратима.

Коротко

Субстратное фосфорилирование в гликолизе - это два прямых переноса фосфата на АДФ: фосфоглицераткиназа берёт его с 1,3-бисфосфоглицерата, пируваткиназа - с фосфоенолпирувата. Каждая реакция идёт дважды на глюкозу, валовый выход 4 АТФ, чистый - 2 АТФ после вычета двух вложенных в подготовительную фазу. Этот механизм не требует кислорода и мембран, поэтому обеспечивает клетку энергией в анаэробных условиях.